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Introducción Los quistes ováricos han sido descriptos en muchas especies de mamíferos domésticos (bovinos, ovinos, caprinos, caninos, roedores) e incluso en el humano. Son frecuentes durante el periodo posparto en el ganado bovino lechero y es una de las principales causas de falla reproductiva y pérdidas económicas, dado que esta condición hace que se alargue el intervalo parto-primer celo, parto-concepción, y por consiguiente parto-parto (Barlett et al., 1986, Lopez-Díaz y Bosu, 1992). La enfermedad quística ovárica (COD) se caracteriza por la presencia de estructuras foliculares ováricas de un diámetro mayor al ovulatorio, 25 mm, que permanecen en el tiempo sin ovular ni atresiarse ocasionando trastornos en la funcionalidad ovárica. Suelen persistir por más de 10 días, ausencia de un cuerpo lúteo (Ribadu et al., 2000). Los estrógenos, que participan en la regulación de varias respuestas ováricas, producen sus acciones a través de dos subtipos de receptores (ER): ERα y ERβ. Aunque el ERβ comparte muchas características funcionales con el ERα, los mecanismos moleculares que regulan su actividad transcripcional y su localización tisular son diferentes para cada subtipo (Kuiper et al., 1996, 1997). En ovarios de varias especies domésticas se han descrito ambos tipos de receptores con una distribución diferencial en cada componente tisular. Particularmente, la variedad ERβ se expresa principalmente en las células de la granulosa. El objetivo del presente estudio fue evaluar y comparar la expresión de los receptores a nivel de los folículos terciarios y quistes foliculares de ovarios normales y con quistes inducidos experimentalmente mediante técnicas de inmunohistoquímica. Materiales y Métodos En esta experiencia se utilizaron 10 vaquillonas de la raza Holando Argentino puros por cruza, de entre 18 y 24 meses de edad, con un peso promedio de 400 kg., las cuales fueron examinadas por tacto rectal y ultrasonografía antes del comienzo de la experiencia para comprobar la normalidad en su tracto reproductor; y la normalidad y regularidad de sus ciclos estrales. Las vaquillonas fueron alojadas en corrales descubiertos; la alimentación estuvo basada en alimento balanceado comercial, heno de alfalfa y silo de maíz y dispusieron de agua ad libitum. Todas las vaquillonas fueron sometidas a la sincronización de sus ciclos estrales mediante el protocolo Ovsynch (Pursley et al., 1995) de la siguiente manera: a cada uno de los vaquillonas se le aplicó GnRH (Receptal®, Intervet Argentina, 4 µg/ml, 5 ml/animal) el día 0, el día 7 se le administraron una inyección de prostaglandina (Iliren®, Intervet Argentina, 0.2 mg/ml, 5 ml/animal) y finalmente se realizó otra inyección de GnRH el día 9. Se realizó la observación del comienzo del estro 24 horas luego del segundo tratamiento con GnRH y luego cada 12 horas. La primer detección de comportamiento de estro fue designado como día cero del ciclo y confirmado por ultrasonografía (Sirois y Fortune, 1998). Durante este período, los animales no recibieron ningún otro tratamiento. Luego de la sincronización del celo, se confeccionaron dos grupos de 5 animales cada uno, el numero 1 fue control y al numero 2 se le realizó la inducción experimental de quistes foliculares. Al grupo 1 fue mantenido en condiciones normales sin tratamiento. En el grupo 2 las vaquillonas fueron tratadas con 100 UI de corticotrofina (ACTH) (1mg/ml de Tetracosactido [corticotropina], Synacthen depot, laboratorio Novartis), cada 12 horas por un periodo de 7 días seguidos a partir del día 15 del ciclo estral. De esta forma se indujeron los quistes foliculares en las vaquillonas, los cuales fueron detectados por ultrasonografía. La extracción de los ovarios se realizó mediante una ovariectomía por el flanco izquierdo. Las muestras de los ovarios fueron reducidas e inmediatamente fijadas en formol bufferado al 10% durante 8 hs a 4ºC, lavándose seguidamente en buffer fosfato salino (PBS) y procesándose siguiendo protocolos de rutina para efectuar la inclusión en parafina (Woods y Ellis, 1994). Luego, se efectuaron cortes seriados, de 4 mm de espesor, los que se montaron en portaobjetos previamente tratados con 3-aminopropyltriethoxysilane (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para hacer una caracterización inicial y evidenciar la morfología general se utilizó la coloración de hematoxilina-eosina. Para la determinación de ERβ sobre las secciones de tejido, se realizó una técnica inmunohistoquímica indirecta (Woods y Ellis, 1994). Los cortes fueron desparafinados, rehidratados y se realizó recuperación antigénica, además de los bloqueos de peroxidasa endógena y uniones inespecíficas. Se utilizó un anticuerpo primario policlonal anti REβ (Polyclonal Anti-Estrogen Receptor-beta BioGenex Cat. No. AR385-5R), un anticuerpo secundario biotinilado, luego estreptavidina-peroxidasa, y finalmente la reacción fue revelada utilizando 3,3´ diaminobencidina como cromógeno (Salvetti et al., 2004). Se realizó la contracoloración nuclear con Hematoxilina Activada. La evaluación de la técnica inmunohistoquímica se realizó por análisis digital de imágenes. Las imágenes generadas con un microscopio Olympus BH2, fueron digitalizadas mediante una cámara SONY CCD-IRIS conectada a una PC. La evaluación de las imágenes se realizó con un analizador digital de imágenes (IMAGE PRO PLUS 4.1.1®). Se determinó el porcentaje de células positivas sobre células totales. Los datos obtenidos fueron evaluados mediante el test T de Student mediante el programa estadístico SPSS 11.0.1 para Windows. Resultados alcanzados El ERβ fue detectado en el núcleo de varios tipos celulares del ovario incluyendo células de la teca externa, teca interna y granulosa de los folículos terciarios antrales, quísticos así como en células del estroma y en células de los vasos sanguíneos. Se encontraron diferencias significativas en la inmunoexpresión de esta proteína entre todas las capas del folículo terciario respecto al de las capas de folículo quístico. El porcentaje de positividad fue mayor en los folículos terciarios de los ovarios normales con respecto a los ovarios quísticos. Los resultados están expresados en la tabla N° 1. Tabla 1. Inmunomarcación de ERβ en las capas de los folículos de ovarios normales e inducidos. Estructura Grupo 1 - Folículo Terciario Grupo 2 - Folículo Quístico Granulosa 83.67 +/- 10.97 61.00 +/- 9.64 Teca Interna 77.33 +/- 16.80 44.67 +/- 1.15 Teca Externa 64.00 +/- 15.72 38.33 +/- 9.29 Conclusiones Muchos de los estudios de las características histológicas y endocrinas de los quistes foliculares son provenientes de material de frigorífico con un historial desconocido ya sea del estado reproductivo del animal como de las características de persistencia y tiempo del folículo quístico. En este estudio, los quistes analizados fueron tomados de los modelos experimentales en los cuales se contaba con la información del tiempo de existencia de los mismos, lo cual nos permite un análisis más exacto del estado estructural y funcional de los quistes foliculares. El patrón de marcación encontrado coincidió con lo descrito en las estructuras ováricas por otros autores, tanto en bovinos como en otras especies (Wang et al., 2000; Jakimiuk et al., 2000; Berisha et al., 2002). En el presente trabajo detectamos diferencias en la inmunomarcación de ERβ en las capas de células de la granulosa entre los animales con y sin COD. Existe evidencia que indicaría que la transcripción del mRNA del ERβ puede ser inhibida (down regulation) en respuesta a elevados niveles de LH circulantes. Wang et al. (2000) demostraron que el ERβ está altamente expresado en los pequeños folículos en crecimiento pero menos en los grandes folículos debido a la habilidad de las gonadotropinas de hacer una regulación hacia abajo de estos receptores. Esto último contrasta con un estudio reciente en el cual se muestra que la inmunreactividad de ERβ fue apenas detectable en el ovario de rata durante el estro. Por otro lado, Couse et al. (2004) utilizando modelos de ratones transgénicos mostraron que este receptor es necesario para la formación de quistes foliculares en animales con altos niveles de LH plasmática constante. Podemos concluir que la disminución en la expresión de este tipo de receptor de estrógenos podría deberse a alteraciones en la secreción de hormonas gonadotrópicas que ocurre durante el desarrollo de la enfermedad y que afecta los mecanismos de regulación de su transcripción.

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