Identificación de células de la granulosa y tecas por PCR en tiempo real, en muestras de células obtenidas por aspiración folicular

DIAZ, PU; AMWEG A; RODRIGUEZ, MF; VELAZQUEZ M; STANGAFERRO M; BERTOLI, J; PANZANI, CG; REY F; SALVETTI, NR; ORTEGA, HH

Cordoba

Congreso; IX Simposio Internacional de Reproducción Animal; 2011

IRAC

La enfermedad quística ovárica ha sido estudiada extensamente en relación a su diagnóstico y tratamiento, sin embargo, en la actualidad es exigua la información acerca de las modificaciones celulares y moleculares ocurridas en el folículo previo al proceso de anovulación. Esto se debe a la dificultad de obtener muestras de tejido ovárico de animales en producción. Diversos estudios han sido realizados sobre casos crónicos y muestras obtenidas en frigorífico que no siempre representan la realidad de los "casos a campo”. Basados en estos antecedentes, nos propusimos obtener, mediante aspirado folicular guiado por ultrasonografía, muestras de quistes foliculares, que permitan la realización de técnicas de Biología Molecular. Para el diagnóstico de los quistes se consideraron estructuras mayores a 18 mm, en ausencia de cuerpo lúteo y con pérdida de tono uterino. Particularmente, caracterizamos la población celular de los aspirados, mediante el análisis de la expresión del ARNm de la enzima CYP19A1 (Aromatasa) propia de las células de la granulosa y de la enzima CYP17A1 (17α Hidroxilasa) presente en células de la teca. Para el aspirado folicular se utilizó un sistema de ultrasonido digital Chison 8300vet equipado con un transductor microconvexo de 5,0 MHz montado en una sonda transvaginal (Watanabe Tecnología Aplicada Ltda., Cravinhos, Brasil). La misma posee una guía para la colocación de una aguja calibre 20G con bisel ecogénico que se conecta por medio de una tubuladura de teflón a tubos contenedores cónicos estériles de 50ml. El aspirado se realizó empleando una bomba de vacío a una presión de 500mm Hg. Se utilizaron 10 vacas raza Holando Argentino en lactancia con Enfermedad Quística Ovárica diagnosticada por ecografía. Una vez que el dispositivo de aspiración fue montado, se introdujo vía vaginal hasta contactar con el fondo de la misma. El quiste folicular fue localizado por tacto rectal, acercado y fijado al transductor de la sonda. Una vez visualizado, se procedió a la introducción de la aguja a través de la pared vaginal y luego a través de la pared del quiste para la toma de muestra, al mismo tiempo que la bomba de vacío fue activada. Inmediatamente luego de la recolección del líquido folicular rico en células de la granulosa, se procedió a su conservación a temperatura de refrigeración (4-6ºC) y se trasladó al laboratorio. El ARNm se extrajo mediante la técnica de Trizol, eliminando posibles contaminaciones de ADN genómico con ADNasa. Se realizó la transcripción reversa con la enzima MMLV Transcriptasa Reversa en un termociclador convencional. El ADN copia obtenido fue sometido a la técnica de PCR en tiempo real (Real Time PCR) en un termociclador Step One (Applied Biosystem) utilizando primers específicos para las enzimas CYP19A1 y CYP17A1, determinando la expresión de ambas enzimas en todas las muestras obtenidas. Los resultados demostraron que mediante la técnica de aspirado folicular, es posible obtener células de teca y granulosa para realizar estudios de biología molecular para la identificación de transcriptos de genes específicos. De esta manera, mediante la técnica de aspirado, sería posible el estudio de mecanismos etiopatogénicos de la enfermedad, teniendo en cuenta que se puede obtener una anamnesis completa de estos “casos a campo” y conocer algunos factores que pudieron haber influenciado en el trastorno anovulatorio.