Superoxide Dismutasa and Glutathione Reductase overexpressed in Lotus japonicus: a tool to study Reactive Oxygen Species incidence during the nitrogen fixation

MARIANA MELCHIORRE, RAMIRO LASCANO, RODRIGO PAROLA, GERMÁN ROBERT, ROBERTO RACCA AND VICTORIO TRIPPI.

Miguel Pereyra Brasil

Congreso; 22nd. Latin-american Conference on Rhizobiology. 1st Brazilian Conference on Biological Nitrogen Fixation.; 2004

RELAR

Legume N2 fixation is particularly sensitive to environmental perturbations. Enviromental stress induces premature nodule senescence, which such as in natural senescence, promotes loss of N2 fixation capacity and increases. This stress-induced characteristics has been linked to increases in reactive oxygen species (ROSs) and/or lowering of antioxidant defenses   La modulación de la defensa antioxidante a nivel foliar, preserva la maquinaria fotosintética, y en las raices, permite el establecimiento de los nódulos y protege la actividad nitrogenasa para sostener la fijación biológica de nitrógeno (FBN). Se postula que la sobreexpresión de las enzimas antioxidantes Superóxido Dismutasa y Glutatión Reductasa (SOD y GR) en plantas de leguminosas incrementará su capacidad para tolerar condiciones de estrés y mantener la actividad fijadora de nitrógeno, sosteniendo la productividad a través de la atenuación de síntomas de senescencia. Lotus japonicus as  one of plant legume models can be easily transformed using Agrobacterium-based protocols   El objetivo de este trabajo es obtener un sistema de plantas de leguminosas transgénicas sobreexpresoras de SOD y GR y evaluar la respuesta del sistema antioxidante y la fijación biológica de nitrógeno en condiciones control y de estrés. Semillas de Lotus japonicus cv Miyakojima fueron escarificadas mecánicamente, desinfectadas y germinadas en medio agarizado conteniendo sales MS al 50% de su concentración y 10 g/l de sacarosa (1/2MS 1%). Plántulas de 6 días fueron diseccionadas en el ápice y la región de unión a los cotiledones se infectó con una colonia fresca de Agrobacterium tumefaciens. Los Agrobacterium se transformaron con los plásmido pChlorSOD y GORT2Gus que codifican para MnSOD y GR respectivamente, ambas bajo el promotor CaM35S y la expresión direccionada a cloroplastos. Los brotes transgénicos aparecieron luego de 6-7 días de cultivo en luz continua a 27°C y fueron transferidos a 1/2MS 1% con 300µg/ml de cefotaxime y 50mg/l de kanamicina. El enraizamiento de los brotes se indujo adicionando a ese  medio de cultivo 1 mg/de IBA. La generación de brotes nuevos desde la zona de infección se produjo en el 97% de las plantas inoculadas GORT2Gus y en el 96% de las transformadas con pChlorSOD La sobrevivencia luego de 3 meses de presión selectiva en kanamicina fue del 66% y 57% respectivamente. La presencia de los transgenes se evaluó por PCR sobre el gen NPTII (resistencia a kanamicina) para ambos tipos de transgénicas. Se observaron  21% de PCR positivos para NPTII en las plantas GORT2Gus y 10 % en las pChlorSOD. Se realizaron también PCR sobre el gen UidA (GUS) de las plantas GORT2Gus y amplificaciones mixtas entre el promotor CaM35S y el gen GOR y CaM35S y el gen MnSOD obteniendose similares porcentajes de eventos positivos. Las plantas se propagaron in vitro mediante estacas nodales  en medio agarizado sin selección y actualmente se mantienen como lineas clonales. Se prevé evaluar la integración de los genes SOD y GR por southern blot y corroborar la inducción de las isoformas adicionales de MnSOD y GR mediante ND-PAGE. Estos clones de propagarán vegetativamente para emplearlos en estudios de tolerancia a estrés y actividad de sistema antioxidante. en sistemas Lotus-Mesorhizobium loti sometidos a condiciones de estrés.