Transformación de Lotus japonicus para sobreexpresión de las enzimas Superoxido dismutasa y Glutation reductasa

MELCHIORRE M , PAROLA R, ROBERT G, LASCANO R, RACCA R Y V.TRIPPI

Santa Rosa La Pampa

Congreso; XXV Reunión Argentina de Fisiología Vegetal; 2004

SAFV

En leguminosas, la fijación biológica del N2 es particularmente sensible a las perturbaciones ambientales. El estrés induce características de senescencia prematura en los nódulos, que al igual que el envejecimiento natural, conlleva a la pérdida de la capacidad de fijar N2 atmosférico, y a inducción de actividades líticas. Estos fenómenos han sido asociados a incrementos en la generación de especies activas del oxígeno (EAOs) y/o a la disminución de la defensa antioxidante. La modulación de la defensa antioxidante a nivel foliar, preserva la maquinaria fotosintética, y en las raices, permite el establecimiento de los nódulos y protege la actividad nitrogenasa para sostener la fijación biológica de nitrógeno (FBN). Se postula que la sobreexpresión de las enzimas antioxidantes Superóxido Dismutasa y Glutatión Reductasa (SOD y GR) en plantas de leguminosas incrementará su capacidad para tolerar condiciones de estrés y mantener la actividad fijadora de nitrógeno, sosteniendo la productividad a través de la atenuación de síntomas de senescencia. El objetivo de este trabajo es obtener un sistema de plantas de leguminosas transgénicas sobreexpresoras de SOD y GR y evaluar la respuesta del sistema antioxidante y la fijación biológica de nitrógeno en condiciones control y de estrés. Semillas de Lotus japonicus cv Miyakojima fueron escarificadas mecánicamente, desinfectadas y germinadas en medio agarizado conteniendo sales MS al 50% de su concentración y 10 g/l de sacarosa (1/2MS 1%). Plántulas de 6 días fueron diseccionadas en el ápice y la región de unión a los cotiledones se infectó con una colonia fresca de Agrobacterium tumefaciens. Los Agrobacterium se transformaron con los plásmido pChlorSOD y GORT2Gus que codifican para MnSOD y GR respectivamente, ambas bajo el promotor CaM35S y la expresión direccionada a cloroplastos. Los brotes transgénicos aparecieron luego de 6-7 días de cultivo en luz continua a 27°C y fueron transferidos a 1/2MS 1% con 300µg/ml de cefotaxime y 50mg/l de kanamicina. El enraizamiento de los brotes se indujo adicionando a ese  medio de cultivo 1 mg/de IBA. La generación de brotes nuevos desde la zona de infección se produjo en el 97% de las plantas inoculadas GORT2Gus y en el 96% de las transformadas con pChlorSOD La sobrevivencia luego de 3 meses de presión selectiva en kanamicina fue del 66% y 57% respectivamente. La presencia de los transgenes se evaluó por PCR sobre el gen NPTII (resistencia a kanamicina) para ambos tipos de transgénicas. Se observaron  21% de PCR positivos para NPTII en las plantas GORT2Gus y 10 % en las pChlorSOD. Se realizaron también PCR sobre el gen UidA (GUS) de las plantas GORT2Gus y amplificaciones mixtas entre el promotor CaM35S y el gen GOR y CaM35S y el gen MnSOD obteniendose similares porcentajes de eventos positivos. Las plantas se propagaron in vitro mediante estacas nodales  en medio agarizado sin selección y actualmente se mantienen como lineas clonales. Se prevé evaluar la integración de los genes SOD y GR por southern blot y corroborar la inducción de las isoformas adicionales de MnSOD y GR mediante ND-PAGE. Estos clones de propagarán vegetativamente para emplearlos en estudios de tolerancia a estrés y actividad de sistema antioxidante. en sistemas Lotus-Mesorhizobium loti sometidos a condiciones de estrés.