Obtención y caracterización de anticuerpos de dominio único derivados de camélidos (nanoanticuerpos o VHH) específicos contra la cepa O1 campos del virus de la Fiebre aftosa para aplicación diagnóstica.

BOZZO JOAQUIN; MATTION, NORA; GRIPPO VANINA

Buenos Aires

Congreso; VXII Congreso Argentino de Virología; 2017

SAV

La Fiebre Aftosa (FA) es una enfermedad viral del ganado de graves repercusioneseconómicas. Existen siete serotipos del Virus de la FA (VFA): O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 yAsia1; habiendo los tres primeros circulado en Argentina. El desarrollo de métodos diagnósticosinnovadores que respondan a las necesidades de control de la FA es de gran interés debido ala elevada variabilidad que presenta el virus, la facilidad de contagio y la susceptibilidad deespecies de interés económico. A su vez, los anticuerpos (Acs) de dominio único derivados decamélidos (Nanoanticuerpos o VHH) representan una herramienta novedosa concaracterísticas únicas en comparación con los Acs convencionales. Se caracterizan por su altaespecificidad, estabilidad, afinidad por el blanco y reducido tamaño. Esto último permite fijarmayor densidad de Acs incrementando notablemente la sensibilidad diagnóstica. Por estarazón, el presente trabajo tuvo como objetivo obtener, expresar y caracterizar preliminarmenteVHH específicos contra la cepa O1/Campos (O1C) del VFA para su posterior aplicación en lainnovación diagnóstica.Para lograr tal objetivo, dos llamas (Lama glama) fueron inmunizadas con la cepa O1C y seconstruyeron dos bibliotecas de Nanoanticuerpos en el vector fagémido pHEN4 a partir de lasangre total periférica de estas llamas. Partiendo de estas bibliotecas inmunes, seseleccionaron fagos que expresaron en su superficie VHH específicos contra la cepa O1C porla metodología de ?Phage Display?. Se observó que 137 de 182 clones seleccionadosreconocieron específicamente tal cepa en ELISA. De estos clones, se eligieron 17 quepresentaron muy alta reactividad en ELISA y no presentaron reactividad cruzada con otrosserotipos del VFA (A24/Cruzeiro, A/Arg/2001 y C3/Indaial). Seguidamente, se estudió ladiversidad de estos clones por digestión enzimática con la enzima de restricción HinfI y seevidenció que 12 de los 17 clones presentaron perfiles de digestión diferentes. En una primeraetapa, 6 de estos clones diferentes fueron sub-clonados en el vector de expresión pHEN6. Sudiversidad y clonado en fase fue corroborado por posterior secuenciación. Luego, estosNanoanticuerpos se expresaron en forma soluble a gran escala en la cepa WK6 de E. coli y seobservó una única banda del tamaño esperado (15Kda) correspondiente VHH en ensayos deWestern blot. La reactividad de estos Acs solubles se caracterizó preliminarmente por ELISA yWestern blot contra los distintos serotipos del VFA.En conclusión, se obtuvieron al menos 12 Nanoanticuerpos diferentes y específicos contra lacepa O1C. De estos 12 VHH, 6 fueron sub-clonados y expresados en forma soluble enbacteria. Estos Nanoanticuerpos se caracterizaron preliminarmente en ensayos de ELISA yWestern blot contra VFA. Estos anticuerpos representan una herramienta para la innovación demétodos diagnósticos actuales y la tipificación del serotipo O1C del VFA