Ensayos preliminares para la generación de un enzimoinmunoensayo que permita detectar y diferenciar los virus encefalitis de Saint Louis y West Nile

LORCH, M.S.; GOÑI, S.E.; SPINSANTI, L.I.; PUBUL MARTIN, P.E.; VARCHAVSKY, I.; CONTIGIANI, M.S.; LOZANO, M.E.

Buenos Aires

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología; 2015

Asociación Argentina de Microbiología

Elgénero Flavivirus está compuesto porun alto número de integrantes que se agrupan antigénicamente en complejos biendefinidos. El virus de la encefalitis de St.Louis (SLEV) integra el complejo de la encefalitis Japonesa, y se haconstituido como una zoonosis emergente de importancia sanitaria en nuestropaís desde el año 2002. Se han registrado casos de encefalitis por SLEV en 11provincias, especialmente en zonas subtropicales y templadas. Por otro lado,nuestro país enfrenta la emergencia del flavivirus West Nile (WNV), el cual ha provocado brotes importantes enNorteamérica luego de su introducción en el año 1999.Eldiagnóstico definitivo de una infección con flavivirus depende casiexclusivamente de la serología. Para su identificación se debe realizar elhallazgo de anticuerpos tipo inmunoglobulina M por la técnica de ELISA decaptura en suero o LCR. Sin embargo esta técnica no es capaz de diferenciarflavivirus antigénicamente relacionados como SLEV y WNV, tal que un resultadopositivo debe ser confirmado por técnicas más específicas como el ensayo deNeutralización. Es necesario destacar que para este ensayo se emplean comoantígenos los virus enteros obtenidos en cultivo celular, lo cual pone enevidencia la dificultad de manipular virus nocivos para los humanos y laimposibilidad de producir antígenos para otras cepas virales que aún no se handetectado en el país pero que circulan en la región. Esta situación plantea la necesidad de desarrollarmétodos de diagnóstico sencillos que permitan diferenciar una infecciónproducida por estos agentes virales. El objetivo de este trabajo se centra enla expresión de la proteína recombinante NS1 de SLEV y WNV en su forma completay el diseño de una construcción que contenga las regiones de mayorinmunogenicidad, con el fin de generar antígenos que permitan establecer unensayo serológico para determinar la identidad del agente etiológico en uncuadro de infección relacionado con flavivirus.En este trabajo se utilizaron las cepas CbaAr-4005 deSLEV y ArEq001 de WNV para el desarrollo de las siguientes actividades: predicciónbioinformática de las regiones inmunogénicas, diseño de construcciones, diseño de primers, obtención de ARN viral, síntesis de ADNc, amplificación de losfragmentos de interés, clonado de los productos de amplificación, transferencia de los marcos abiertos de lectura avectores de expresión, ensayos de expresión, purificación y estudio antigénicode las proteínas mediante Western Blotting y ELISA.Se amplificaron las regiones codificantes propuestas, clonándose luegoen vectores comerciales y transfiriéndose al vector de expresión pET-22b. Estevector permite obtener la secuencia de NS1 unida a una cola de seis histidinas,generándose la proteína recombinante NS1-HT. Se optimizaron las condiciones deexpresión de NS1-HT de ambos virus. Se logró confirmar su identidad a través de WesternBlotting con sueros específicos y con sueros comerciales quereconocen a la cola de histidinas. Por otro lado, se iniciaron losenzimoinmunoensayos, observando la capacidad de detección de los diferentessueros teniendo en cuenta las proporciones de antígeno y la solución de adhesióna la placa. Además, como una alternativa a la proteína completa, se realizaronlas predicciones de los sitios de mayor inmunogenicidad y se diseñaron tresconstrucciones que permitirán la expresión de varios epítopes unidos porglicinas, teniendo además la opción de combinar los diferentes constructos paraobtener una mayor respuesta diferencial.