Producción recombinante de antígenos en el desarrollo de un método serológico para la detección de encefalitis flavivirales de importancia local

LORCH, M.S.; GOÑI, S.E.; STEPHAN, B.I.; SPINSANTI, L.I.; PUBUL MARTIN, P.E.; VARCHAVSKY, I.; CONTIGIANI, M.S.; LOZANO, M.E.

La Plata

Congreso; III Congreso Panamericano de Zoonosis y VIII Congreso Argentino de Zoonosis; 2014

Asociación Argentina de Zoonosis

INTRODUCCIÓN: El género Flavivirus está compuesto por un alto número de integrantes que se agrupan antigénicamente en complejos bien definidos. El virus de la encefalitis de St. Louis (SLEV) integra el complejo de la encefalitis Japonesa, y se ha constituido como una zoonosis emergente de importancia sanitaria en nuestro país desde el año 2002. En el año 2005 se produce, en la provincia de Córdoba, el primer brote fuera de Estados Unidos. Se han registrado casos de encefalitis por SLEV en 11 provincias, especialmente en zonas subtropicales y templadas [1]. Por otro lado, nuestro país enfrenta la emergencia del flavivirus West Nile (WNV), el cual ha provocado brotes importantes en Norteamérica luego de su introducción en el año 1999 [2]. Los ciclos de transmisión que mantienen activo a SLEV y WNV en América poseen como vector a mosquitos del género Culex. La amplificación viral ocurre en aves tales como palomas y gorriones, mientras que el hombre y los caballos actúan como hospedadores finales, ya que los títulos de viremia son insuficientes para infectar mosquitos vectores [3]. El diagnóstico definitivo de una infección con flavivirus depende casi exclusivamente de la serología. Para su identificación se debe realizar el hallazgo de anticuerpos tipo inmunoglobulina M por la técnica de enzimoinmunoensayo de captura en suero o LCR. Sin embargo esta técnica no es capaz de diferenciar flavivirus antigénicamente relacionados como SLEV y WNV, tal que un resultado positivo debe ser confirmado por técnicas más específicas como el ensayo de Neutralización. Es necesario destacar que para este ensayo se emplean como antígenos los virus enteros obtenidos en cultivo celular, lo cual pone en evidencia la dificultad de manipular virus nocivos para los humanos y la imposibilidad de producir antígenos para otras cepas virales que aún no se han detectado en la región pero que circulan en países limítrofes. Esta situación plantea la necesidad de desarrollar métodos de diagnóstico sencillos que permitan diferenciar una infección producida por estos agentes virales. El objetivo de este trabajo se centra en la expresión de la proteína recombinante NS1 de SLEV y WNV para generar antígenos que permitan establecer un ensayo serológico claro y preciso para determinar la identidad del agente etiológico que da lugar a un cuadro de infección relacionado con flavivirus. MATERIALES Y METODOS: En este trabajo se utilizaron las cepas CbaAr-4005 de SLEV y ArEq001 de WNV para el desarrollo de las siguientes actividades: diseño de primers, obtención de ARN viral, síntesis de ADNc, amplificación de los fragmentos de interés, clonado de los productos de amplificación, transferencia de los marcos abiertos de lectura a vectores de expresión, ensayos de expresión, purificación y estudio antigénico de las proteínas mediante Western Blotting. RESULTADOS: Se amplificaron las regiones codificantes propuestas, clonándose luego en vectores comerciales y transfiriéndose al vector de expresión pET-22b. Este vector permite obtener la secuencia de NS1 unida a una cola de seis histidinas, generándose la proteína recombinante NS1-HT. Se optimizaron las condiciones de expresión, obteniéndose buenos niveles de NS1-HT de cada virus. Se logró confirmar su identidad a través de Western Blotting con sueros específicos y con sueros comerciales que reconocen a la cola de histidinas fusionada en el extremo carboxilo. DISCUSIÓN: Estos resultados marcan el comienzo del desarrollo de un nuevo método de diagnóstico que facilitaría tanto la detección y diferenciación de los agentes etiológicos SLEV y WNV en una infección en humanos, como el seguimiento epidemiológico de estos virus en animales. Como perspectiva se plantea la alternativa, de clonar y expresar construcciones que contengan diferentes epítopes de la proteína NS1. Esta posibilidad permitiría analizar la inmunogenicidad de distintas combinaciones de epítopes y así seleccionar los diferenciales para cada virus. BIBLIOGRAFÍA: [1] Spinsanti et al. St. Louis Encephalitis in Argentina: the First Case Reported in the Last Seventeen Years. Emerg Infect Dis 2005; 9(2):271?273. [2] Diaz et al. West Nile Virus in birds, Argentina. Emerging Infectious Diseases 2008; 14(4):689-691. [3] Spinsanti et al.Eco epidemiology overview of St. Louis encephalitis in Córdoba, Argentina. Revista facultad de Ciencias Médicas. 2009; 66(1):52-59.