Generación de la proteína recombinante NS1-HT de los virus encefalitis de Saint Louis y West Nile en un sistema bacteriano

LORCH, M.S.; STEPHAN, B.I.; PUBUL MARTIN, P.E.; LOZANO, M.E.; CONTIGIANI, M.S.; SPINSANTI, L.I.; GOÑI, S.E.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XXXIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2013

Sociedad Argentina de Virología

El género Flavivirus está compuesto por un alto número de integrantes que se agrupan antigénicamente en complejos bien definidos. El virus de la encefalitis de St. Louis (SLEV) integra el complejo de la Encefalitis Japonesa, y se ha constituido como una zoonosis emergente de importancia sanitaria en nuestro país. Por otro lado, nuestro país enfrenta la emergencia del Flavivirus West Nile (WNV), el cual ha provocado brotes importantes en Norteamérica luego de su introducción en el año 1999.El diagnóstico definitivo de una infección con Flavivirus depende casi exclusivamente de la serología. Para su identificación se debe realizar el hallazgo de anticuerpos tipo inmunoglobulina M por la técnica de enzimoinmunoensayo de captura en suero o LCR. Sin embargo esta técnica no es capaz de diferenciar Flavivirus antigénicamente relacionados como SLEV y WNV, tal que un resultado positivo debe ser confirmado por técnicas más específicas como el ensayo de Neutralización.En una infección secuencial con Flavivirus, el pico de anticuerpos es más alto y persisten por períodos más largos que en la respuesta primaria. Las reacciones serológicas cruzadas deben ser resueltas mediante Neutralización con una batería de virus del mismo género circulantes en la región. Sin embargo, los resultados serológicos resultantes de infecciones secundarias frecuentemente son indeterminados o de difícil interpretación.Esta situación plantea la necesidad de desarrollar métodos de diagnóstico sencillos que permitan diferenciar una infección producida por estos agentes virales. El objetivo de este trabajo se centra en la expresión de la proteína recombinante NS1 de SLEV y WNV para generar antígenos que permitan establecer un ensayo serológico claro y preciso para determinar la identidad del agente etiológico que da lugar a un cuadro de infección relacionado con Flavivirus.En este trabajo se utilizaron las cepas CbaAr-4005 de SLEV y ArEq001 de WNV para el desarrollo de las siguientes actividades: diseño de primers, obtención de ARN viral, síntesis de ADNc, amplificación de los fragmentos de interés, clonado de los productos de amplificación, transferencia de los marcos abiertos de lectura a vectores de expresión, ensayos de expresión, purificación y estudio antigénico de las proteínas mediante Western Blotting.Se amplificaron las regiones codificantes propuestas, clonándose luego en vectores comerciales y transfiriéndose al vector de expresión pET-22b. Este vector permite obtener la secuencia de NS1 unida a una cola de seis histidinas, generándose la proteína recombinante NS1-HT. Se optimizaron las condiciones de expresión, obteniéndose buenos niveles de NS1-HT de ambos virus. Se logró confirmar su identidad a través de Western Blotting con sueros específicos y con sueros comerciales que reconocen a la cola de histidinas fusionada en el extremo carboxilo.