Análisis funcional de las proteínas Z y N del virus Junín.

BORIO, C.S.; BILEN, M.F.; VALLI, A.; ISERTE, J.A.; LOZANO, M. E.

Vaquerías, Valle Hermoso

Congreso; XXXII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2012

Sociedad Argentina de Virología

RESUMEN Introducción Los familia Arenaviridae se caracteriza por incluir virus de RNA simple cadena de polaridad ambisentido, con un genoma dividido en dos segmentos y 4 marcos de lectura abiertos. La estrategia de replicación de estos virus incluye intermediarios doble cadena, los cuales son blanco de detección para los sistemas de defensa celulares contra virus de estas características. Esta familia viral contiene varios miembros causantes de Fiebre hemorrágicas en humanos, en particular la Fiebre hemorrágica Argentina causada por el Virus Junín, lo que nos indica la presencia de sistemas de evasión de la respuesta inmune del huésped, más específicamente del sistema de RNAi.   Objetivos El objetivo del presente trabajo fue estudiar la función de las proteínas Z y N del virus Junín en el proceso de evasión a la inmunidad de la célula huésped. Metodología y Resultados Para evaluar la respuesta del sistema de silenciamiento de RNA (RNAi) de la célula y optimizar los parámetros de transfección, sensibilidad e interferencia, en primer lugar se realizaron ensayos de trasnfección transitoria en cultivos de células 293T utilizando el plásmido indicador (pCAGGS-GFP) y el siRNA sintético del gen GFP. Una vez obtenidos niveles significativos de interferencia, se construyeron dos plásmidos de expresión conteniendo el ORF de la proteína Z y la nucleoproteína N del virus Junín, bajo la regulación de los promotores de CMV y 35S. A partir de los  vectores obtenidos se realizaron ensayos de transfección transitoria para evaluar la funcionalidad de las proteínas Z y N en la supresión del mecanismo de RNA de interferencia de la célula. Estos consistieron en la co-transfección del plásmido pCAGGS-GFP, el vector conteniendo el ORF de N o Z junto con el siRNA de GFP. Los resultados se compararon con las condiciones control, en ausencia de Z y N. En presencia de la proteína de matriz Z se observó una marcada disminución de la fluorescencia, la cual se hipotetiza que sea consecuencia de una inhibición general del mecanismo de traducción, como ha sido reportado para otros virus de la familia. Los ensayos con N mostraron un aumento de la expresión de GFP, lo que indicaría que N podría interferir directa o indirectamente con el mecanismo de RNA de interferencia de la célula. Estos ensayos fueron realzados en paralelo en plantas de tabaco, mediante infiltración con Agrobacterium. En estos ensayos se utilizo como control positivo de la represión del sistema siRNA se utilizó la proteína p1b del ipomovirus del amarillamiento de las venas del pepino. En este caso se observaron resultados similares a los obtenidos con la proteína N, mientras que no se observó ningún efecto para la proteína Z. Estos resultados sugieren que la nucleoproteína N estaría involucrada directa o indirecta en la supresión de la respuesta celular vía RNAi, mediante un mecanismo genérico dado que afecta tanto a células de mamífero como vegetales. Por otro lado, la proteína Z en células de mamífero evidenció una actividad supresora de la traducción.