Microtúbulos y AKAP350: Reguladores clave en la formación del?brush border? inducida por LKB1.

TONUCCI FM; ALMADA E; FERRETTI AC; HIDALGO F; FAVRE C; LAROCCA MC; KAVERINA I

Congreso; LX Reunión Científica Anual de la SAIC; 2015

SAIC

La estructura apical de brush border en los enterocitos es la encargada de regular el transporte de nutrientes en el intestino. La sola activación de la kinasa LKB1 promueve el desarrollo de un programa de polaridad celular epitelial en células individuales que finaliza con la formación de un brush border rico en actina. AKAP350 (AKAP9) es una proteína de anclaje de PKA que participa en la nucleación de microtúbulos en el aparato de Golgi y centrosomas. Estudios previos de nuestro grupo demostraron la relevancia de AKAP350 y microtubulos derivados de estas organelas en diferentes procesos de adquisición de polaridad tales como el desarrollo de estructuras canaliculares en células hepáticas y el posicionamiento del centrosoma durante la migración celular.El objetivo de este trabajo fue evaluar la participación de los microtubulos derivados de Golgi y/o centrosomas en la formación del brush border. Utilizamos células W4 geneticamente modificadas para expresar establemente LKB1 y STRAD inducible por doxiciclina. La inducción de STRAD estabiliza a LKB1 promoviendo su activación y la subsecuente polarización epitelial de células aisladas que desarrollan rapidamente un brush border apical. Luego de la activación con doxiciclina despolimerizamos completamente los microtubulos con nocodazol en células W4. En estas condiciones las células no fueron capaces de formar nuevos brush borders. Con el fin de analizar la dinámica de dicho proceso transfectamos previamente las células con el marcador de plus-ends EB3-Cherry y realizamos experimentos de live imaging durante la activación con doxiciclina. En estos estudios observamos el direccionamiento de los pus-ends hacia el brush border previo al enriquecimiento de actina.Con el fin de evaluar separadamente la participación de los microtubulos derivados de Golgi y centrosomas expresamos transientemente AKAP350CTD (que desplaza AKAP350 de centrosomas) o AKAP350NTD (que deslocaliza parcialmente esta proteína de Golgi). Alternativamente tratamos las células con Brefeldina A para desorganizar completamente el Golgi durante la activación con doxiciclina. Luego cuantificamos en cada caso el porcentaje de células con brush border utilizando microscopia confocal. En estos estudios no obsevamos diferencias en la formación de brush border luego de la expresión de AKAP350NT o Brefeldina A, pero si una clara reducción en la formación de brush border en células que expresaban AKAP350CTD.Nuestros resultados relevan la relevancia de los microtubulos en la formación del brush border y la participación especifica de AKAP350 centrosomal en este proceso.