STSBTC-3, SERÍN PROTEASA DE SOLANUM TUBEROSUM COMO NUEVO AGENTE

PEPE, A.; GUSTAVO DALEO; MARÍA G. GUEVARA.

Santa Fe

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos SAProBio 2014; 2014

STSBTC-3, SERÍN PROTEASA DE SOLANUM TUBEROSUM COMO NUEVO AGENTE ANTICOAGULANTE Y FIBRINOGENOLÍTICO CON POSIBLES APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS. Pepe, Alfonsoa; Daleo, R. Gustavoa; Guevara, M. Gabrielaa aLaboratorio de Bioquímica Vegetal, Instituto de Investigaciones Biológicas, IIB (UNMdPCONICET), Funes 3250, 7600, Mar del Plata, Argentina, gguevara@mdp.edu.ar Introducción La coagulación de la sangre y la fibrinólisis son dos importantes procesos que participan de la hemostasia e involucran una serie de serín proteasas (Lijnen, 2002). El fibrinógeno es una proteína heterotrimérica compuesta por tres subunidades Aα, Bβ and ƴ. La trombosis intravascular resultante de la agregación de fibrina en las arterias es la principal causa de desórdenes cardiovasculares incluyendo infarto de miocardio (Walker, Davidson, & Thomson, 1985). Los agentes fibrinolíticos actualmente disponibles para el tratamiento de la trombosis son activadores del plasminógeno como el factor tisular y activadores de plasminógeno tipo urokinasa. Todos ellos poseen efectos secundarios adversos. La búsqueda de nuevas enzimas fibrinogenolíticas para el tratamiento de desórdenes trombóticos es por lo tanto de gran importancia. Previamente hemos reportado la purificación y caracterización parcial de una serín proteasa extraída de hoja de Solanum Tuberosum (Fernández, Daleo, & Guevara, 2012) llamada StSBTc-3. El objetivo de este trabajo fue evaluar y caracterizar la actividad fibrinogenolítica y anticoagulante de StSBTc-3. Metodología La actividad anticoagulante de la enzima se midió evaluando el tiempo de trombina (TT) utilizando el kit de Wiener Lab (http://www.wiener-lab.com.ar/) de un pool de plasmas normales previamente incubado con distintas dosis de la proteasa. La actividad fibrinogenolítica de StSBTc-3 fue analizada por SDS-PAGE 10% según Laemmli, 1970, incubando a distintos tiempos 4 ug de StSBTc-3 con fibrinógeno purificado de plasma humano. El fibrinógeno se obtuvo precipitando la fracción de euglobulinas con ácido acético 1% (Lacroix, C, Box, & Wagner, 1996). Para la caracterización de la actividad fibrinógenolítica evaluamos el efecto del pH y la temperatura sobre la misma. El efecto del pH fue monitoreado en un rango de pH de 3 a 11 utilizando distintos buffers. Para determinar la temperatura óptima 5 ug de StSBTc-3 fueron incubados junto con fibrinoógeno humano por 60 min en un rango de temperaturas de 10 a 90 ºC a con incrementos de 10 ºC. Para determinar los valores de actividad relativa las muestras se corrieron en geles de acrilamida-bis acrilamida 10% en condiciones desnaturalizantes (Laemmli, 1970). Se realizaron las densitometrías de las bandas correspondientes a las cadenas de fibrinógeno utilizando el software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) y se relativizaron los valores respecto de los controles respectivos. Resultados La evaluación del tiempo de trombina (Fig. 1) mostró que la enzima StSBTc-3 posee actividad anticoagulante de forma dosis dependiente, siendo el efecto máximo a 14 μg/ml similar a otras serin proteasas reportadas anteriormente (Patel, Kawale, & Sharma, 2012b). Los resultados obtenidos (Fig. 2) muestran que StSBTc-3 es capaz de degradar fibrinógeno degrandando en mucha mayor medida las subunidades β y ƴ respecto de la α. Estos resultados son alentadores ya que muestran una especificidad diferente a la de otras serín proteasas vegetales con actividad fibrinogenolítica (Patel, Kawale, & Sharma, 2012a; Patel et al., 2012b). La enzima StSBTc-3 (Fig. 3) mostró ser activa en un rango de pH 6 a 13 con un pH óptimo de 8. La actividad relativa a pH 6 y a pH 8 fue de 55% y 95% respectivamente y se reduce drásticamente por debajo de 5. A diferencia de otras enzimas de plantas fibrinogenolíticas (Shivaprasad, Rajesh, Nanda, Dharmappa, & Vishwanath, 2009), StSBTc-3 mostró gran estabilidad a pH mayores que 9. La proteasa StSBTc-3 (Fig. 4) fue activa en un rango de temperaturas de 15 a 70 ºC y su temperatura óptima fue de 40 ºC.