Posibles roles de las aspartil proteasas de papa (StAPs) en la respuesta de defensa de la papa frente a la infección con P. infestans.

GUEVARA, MG; OLIVA, C; MENDIETA, J; PAGANO, M; MUÑOZ, F; ANDREU, A Y DALEO, G.

Mar del Plata. Argentina

Congreso; XXIII Congreso de la Asociación Latinoamericana de la Papa y IV Seminario Latinoamericano de Uso y Comercialización de la Papa; 2008

INTA- ProPAPA- ALAP- Federación Nacional de Productores de papa.

Posibles roles de las aspartil proteasas de papa (StAPs) en la respuesta de defensa de la papa frente a la infección con P. infestans. Guevara, MG; Oliva, C; Mendieta, J; Pagano, M; Muñoz, F; Andreu, A y Daleo, G. Instituto de Investigaciones Biológicas UNMDP-CONICET. Funes 3250 4º Piso. Mar de Plata Argentina. gguevara@mdp.edu.ar Introducción P. infestans (Mont.) De Bary es un patógeno con un amplio rango de hospedantes, todos ellos miembros de la familia Solanaceae, dentro de esta familia, los cultivos de papa y de tomate son los hospedantes económicamente más importantes [Birch, P. and Whisson, S. (2001); Smart, C. and Fry W. (2001); Ristaino, J. (2002); Kamoun, S. and Smart C. (2005)]. La enfermedad del tizón tardío de la papa (Solanum tuberosum), causada por este patógeno, es una de las más importantes en los cultivos de papa del mundo, responsable de la devastación de la producción de papa a mediados del siglo diecinueve.  Estudios reportados por el INTA-Balcarce muestran las enormes pérdidas económicas en los cultivos de papa que causa este patógeno tanto en el ámbito local, nacional como internacional [Capezio, S. and Huarte, M. (2002); Mantecón, J. (2003)]. Sumadas a las pérdidas económicas, existen enormes pérdidas ambientales en todo el mundo ya que la aplicación de pesticidas para evitar y acotar la infección tiene un altísimo costo tanto económico como ambiental [ Mackay, G. (1996)]. Existen evidencias que sugieren que las proteasas de origen vegetal son importantes y poseen diversos roles en la defensa de las plantas frente al ataque de patógenos. Un ejemplo de esto es un grupo de proteasas apoplásticas las cuales han sido asociadas a la respuesta de defensa [ Kruger J. et al. (2002)]. El objetivo de este trabajo es mostrar todos los resultados reportados por nuestro grupo de investigación en lo que respecta al rol de las StAPs en la repuesta de defensa de la papa frente al ataque por P. infestans. Materiales y métodos: Para llevar a cabo los objetivos propuestos, las proteínas StAP1y StAP3 fueron purificadas a homogeneidad a partir de hojas y tubérculos respectivamente [ Guevara, M.G., et al. (1999); Guevara, M.G., et al. (2001)]. El fluido intercelular fue obtenido del tejido que rodea al sitio de inoculación  de acuerdo a lo descripto por Guevara et al. (2002); (2004). Determinación de la actividad antimicrobiana: 1,5 x 103 quistes/ml de P. infestans fueron incubados en presencia de distintas concentraciones de StAPs; 0,714 µM BSA; 0,714 µM pepsina o agua, según lo descrito por Guevara et al. (2005). La inhibición de la germinación fue cuantificada utilizando un microscopio NIKON Eclipse E200 (Nikon, Tokyo, Japan). Los controles positivos incluyeron quistes tratados con 0,5 % (p/p) Triton X-100. La integridad de las membranas fue evaluada utilizando la sonda SYTOX Green (Molecular Probes) [Mendieta et al. (2006)]. Viabilidad de células de tabaco BY2: 500 µl de suspensiones celulares de tabaco BY2 fueron tratados con distintas concentraciones de StAPs, en medio MS, durante 2 horas a temperatura ambiente y evaluada añadiendo 250 µl de 1 % Azúl de Evans a cada tratamiento [Mendieta et al. (2006)] Resultados Específicamente en lo que respecta a las proteasas de plantas involucradas en la respuesta de defensa, durante los últimos 9 años, en nuestro laboratorio hemos estudiado la correlación entre el grado de resistencia a campo de diferentes cultivares de papa a P. infestans y el nivel de expresión de proteínas, entre estas aspartil proteasas, en hojas y tubérculos de papa (los dos órganos por los cuales ingresa este patógeno a la planta). Inicialmente identificamos tres StAPs, una de tubérculos (StAP1) [Guevara et al. (1999)] y dos de hojas (StAP2 y StAP3) [Guevara et al. (2001)]. Conjuntamente, aislamos un cDNA que codifica en hojas de papa para una AP al cual hemos denominado StAsp (GenBank accesión number: AY672691). Resultados obtenidos de Northern blots utilizando como sonda el cDNA StAsp corroboran los resultados obtenidos por Western blots en lo que respecta a un mayor grado en la expresión de APs en hojas infectadas con P. infestans en cultivares con alta resistencia horizontal a este patógeno [Guevara et al. (2002); (2004); (2005)]. Adicionalmente, hemos observado un incremento en la expresión de las StAPs tanto en hojas como en tubérculos de papa infectados o no, en plantas tratadas con inductores químicos de la respuesta sistémica [Andreu et al. (2006)]. Por otra parte, dos de estas isoformas StAP1 y StAP3 han sido purificadas y caracterizadas; ambas están localizadas en el apoplasto y poseen actividad citotóxica selectiva ya que son capaces de producir in vitro la muerte celular de estructuras infectivas (esporas e hifas) de P. infestans y F. solani, dos patógenos de papa; pero no tienen ningún efecto sobre la viabilidad de cultivos celulares de tabaco [Mendieta et al. (2006)]. La concentración molar a la cual las StAPs ejercen su actividad microbicida frente a patógenos vegetales in vitro es del mismo orden de magnitud y en algunos casos mucho menor a lo descripto para otras proteínas vegetales con actividad microbicida [Niderman , T. et al. (1995); Liu; Y. et al. (2001)]. Figura 1. Análisis por Western blot de la inducción temporal de StAPs en hojas de papa infectadas por P. infestans. Todas las muestras corresponden a 3 mg de peso fresco de hojas de plantas control (calle 1), y de plantas con 14 (calle 2), 24 (calle 3), 48 (calle 4) y 72 (calle 5) h. de infección con zoosporas de P. infestans. (A) cultivar Pampeana INTA (B) cultivar Bintje.   Figura 2. Análisis por western blot de la inducción temporal de la StAPs en fluido intercelular de tubérculos de papa. Las muestras corresponden a 2 mg de peso fresco. (A) cultivar Pampeana-INTA (B) cultivar Bintje. Calle 1: tubérculos sanos; calles 2, 4 y 6: 14, 24 y 38 h. discos inoculados con agua (daño mecánico); calles 3, 5 y 7: 14, 24 y 38 h. posteriormente al daño mecánico y a la inoculación con zoosporas de P. infestans   Discusión Todos estos resultados sugieren que las StAPs podrían tener un rol en la respuesta de defensa de las plantas frente al ataque por microorganismos, ya sea ejerciendo directamente su acción sobre el patógeno y/o participando en la inducción y/o siendo parte de la respuesta de defensa de la planta. Por otra parte, estos resultados contribuyen por un lado, al conocimiento general sobre la resistencia a este patógeno y paralelamente, a la identificación de marcadores moleculares relacionados con la resistencia horizontal de especies de solanáceas que podrían generar herramientas de gran valor en programas de producción vegetal. Bibliografia Andreu, A. et al. (2006). J. Pest Management Sc. 62:162-170. Birch P. and Whisson S.  (2001).Mol. Plant Pathol. 2, pp. 257–263. Capezio, S. and Huarte, M. (2002). Boletin informativo INTA Actualidad Papera.1: 3. Guevara, M.G. et al. (2002). European Journal of Plant Pathology. 108: 131-137. Guevara, M.G. et al. (1999). Physiol. Plantarum 106, 164-169. Guevara, M.G. et al. (2001). Physiologia Plantarum 112 (3): 321-326. Guevara, M.G. et al. (2004). J. Plant Pathol. 86: 233-238. Guevara, M.G. et al. (2005). Plant Physiol. & Biochem. 43:882-889. Kamoun, S. and Smart, C. (2005). Plant Dis. 89: 692-699. Kruger J. et al. (2002). Science 296: 744–747. Liu, Y., et al. (2001). Plant Physiol 127: 1788–1797. Mackay, G. (1996). CIP circular. 22: 1-5. Mantecón, J. (2003). 20º .Jornadas De Actualización Profesional En Cultivos De Cosecha Gruesa. Mendieta, J. et al. (2006). Microbiology. 152 2039-2047. Niderman, T. et al. (1995). Plant Physiol. 108: 17-27. Ristaino, J. (2002); Microbes and Infection. 4:1369-1377. Smart, C. and Fry, W. (2001). Biological Invasions 3:235-243. Woloshuk  et al. (1991) The Plant Cell, Vol. 3, 619-628.