Puesta a punto de la medición de actividad de una enzima bisustrato para emplearse como trabajo práctico de un curso universitario

JJ INCICCO; RM. GONZÁLEZ-LEBRERO; SB. KAUFMAN

La Plata, Buenos Aires, Argentina

Congreso; XXXVII reunión anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB); 2008

Sociedad Argentina de Biofísica

<!-- /* Style Definitions */ p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-parent:""; margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:12.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-fareast-font-family:"Times New Roman";} @page Section1 {size:612.0pt 792.0pt; margin:70.85pt 3.0cm 70.85pt 3.0cm; mso-header-margin:36.0pt; mso-footer-margin:36.0pt; mso-paper-source:0;} div.Section1 {page:Section1;} --> La asignación de un modelo cinético a una reacción enzimática bisustrato es una actividad didáctica apropiada para la integración y puesta en práctica de varios de los contenidos que contemplan los programas generales de asignaturas que profundizan en la cinética enzimática: diseño de experimentos en base a conocimientos disponibles sobre el sistema y a criterios estadísticos para la determinación de parámetros; identificación experimental de condiciones de estado estacionario; análisis estadístico de los datos; asignación de modelos y el problema experimental de discernir entre ellos, por mencionar algunos. Por otro lado, un sistema seleccionado con fines didácticos no debe excederse en complicaciones, en particular en aquellas cuya resolución no involucra la aplicación de conocimientos relevantes para el curso, no son formativamente importantes o que incluso no permitan el desarrollo del trabajo en un tiempo razonable. La reacción de oxidorreducción de NADH con aceptores de electrones artificiales (A) catalizada por la NADH:Ubiquinona oxidorreductasa(NUO) (mamíferos) puede ser un sistema apropiado: NADH + nAox -> NAD + nAred, n = 1 o 2, según el aceptor. Algunos ejemplos de aceptores artificiales que esta enzima reconoce como sustratos son 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP), ferricianuro y hexaaminorutenio(III) (HAR). El avance dicha reacción puede visualizarse espectrofotométricamente en forma continua midiendo la absorción de, por ejemplo, DCPIP (604nm) y/o del NADH (340nm). Bajo condiciones experimentales simples –temperatura ambiente, sin protección del aire y con algún método de mezclado en menos de 20s- se obtienen medidas de velocidad de reacción con buena precisión y reproducibilidad. Todos los reactivos empleados son de fácil disponibilidad y no requieren cuidados especiales en su manejo. En este trabajo se presentarán los resultados de la puesta a punto del sistema NUO-NADH-DCPIP, y la evaluación de su utilidad como actividad práctica en el marco de un curso universitario de cinética enzimática