Estado ocluido en la Bomba de Ca2+ de membrana plasmática: Optimización del sistema de medida

M. FERREIRA GOMES; MC DE LA FUENTE; RM. GONZÁLEZ-LEBRERO; RC. ROSSI; JPFC ROSSI

La Plata, Buenos Aires, Argentina

Congreso; XXXVII reunión anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB); 2008

La bomba de Ca2+ de membrana plasmática (PMCA) es una proteína transmembrana que acopla el transporte de Ca2+ hacia el medio extracelular con la hidrólisis de ATP en ADP y ortofosfato inorgánico. Su funcionamiento es esencial para el mantenimiento de la concentración de Ca2+ intracelular. Su ciclo de reacción involucra la formación de intermediarios fosforilados y la existencia de transiciones conformacionales, tanto entre formas fosforiladas (E1P<->E2P) como desfosforiladas (E1<->E2). Se postula que el Ca2+ se encuentra ocluido en la forma E1P luego de unirse a sitios citoplasmáticos de la enzima y antes de ser liberado al exterior celular, que ocurriría luego de la transición E1P->E2P. El objetivo de este trabajo es identificar y caracterizar el intermediario en el que el Ca2+ estaría ocluido, E1P(Ca2+). Un punto clave para el éxito de estos estudios es trabajar con microsomas con suficiente abundancia en PMCA, lo cual se logró sobreexpresando la enzima en células Sf9 mediante un sistema de Baculovirus. Esto produjo un aumento de al menos diez veces en la actividad de la enzima. Un segundo punto para optimizar las condiciones de trabajo es que, durante las reacciones, la mayor parte de la enzima se encuentre en el intermediario E1P(Ca2+). Esto se logra agregado LaIII que bloquea el cambio conformacional E1P->E2P.Para saber si la concentración de EP (que en presencia de LaIII se encontraría mayoritariamente como E1P) es compatible con la cantidad Ca2+ ocluido en la bomba, se midió EP utilizando [g-32P]ATP, desnaturalización y precipitación en medio ácido seguido de electroforesis en SDS y autorradiografía (Echarte y col. Anal. Biochem. 289, 267-273, 2001).  La cantidad de EP medida fue cercana a 800 pmol EP/mg PMCA, compatible con resultados de la cantidad de Ca2+ que presumiblemente se ocluye en la PMCA, obtenidos en condiciones similares en nuestro laboratorio.Experimentos en los que se midió la cantidad de EP en función de la concentración de PMCA mostraron un aumento de la cantidad de EP por masa de PMCA a medida que la concentración de proteína disminuía. Estos resultados concuerdan con otros obtenidos en nuestro laboratorio (Vanagas y col, Biochim Biophys Acta. 1768(6):1641-9. 2007) en los que la actividad Ca2+-ATPasa de la PMCA aumenta con la disminución de la concentración de la enzima. Con subsidios de ANPCYT, CONICET y UBACYT