Estabilidad térmica de la Na+/K+-ATPasa, efecto de los ligandos naturales

SB. KAUFMAN; FL. GONZÁLEZ FLECHA; RM. GONZÁLEZ-LEBRERO

Los cocos, Córdoba, Argentina

Congreso; XXXVIII reunión anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB); 2009

Sociedad Argentina de Biofísica (SAB)

<!-- /* Style Definitions */ p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-parent:""; margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:12.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-fareast-font-family:"Times New Roman";} @page Section1 {size:612.0pt 792.0pt; margin:70.85pt 3.0cm 70.85pt 3.0cm; mso-header-margin:36.0pt; mso-footer-margin:36.0pt; mso-paper-source:0;} div.Section1 {page:Section1;} --> La Na+/K+-ATPasa (NKA) es una proteína integral de membrana constituida por dos sub-unidades: una alfa, formada por cuatro dominios estructurales (uno transmembránico y tres intracelulares), y una beta. Transporta activamente entre la célula y el medio externo tres Na+ y dos K+ por cada molécula de ATP hidrolizada. Durante su ciclo de trabajo alterna entre dos estados conformacionales denominados E1 y E2, y se generan los denominados "estados ocluidos", en los cuales los iones transportados se encuentran atrapados en el interior de la proteína. En el presente trabajo se estudió la estabilidad térmica de la NKA empleando como criterio de integridad la Actividad ATPasa, la cantidad de Rb+ ocluido (Rbocl), la fluorescencia intrínseca y la elipticidad en el UV lejano. Estas determinaciones se realizaron luego de preincubar la enzima durante distintos tiempos a varias temperaturas (48-57ºC) y en presencia de diversos ligandos. Estudiamos la estabilidad de la NKA distinguiendo entre sus confórmeros E1 y E2, respectivamente en presencia de Na+ y K+ o Rb+. Además se estudió el efecto del Mg2+ (activador esencial de la bomba). Observamos que en todos los casos la actividad Na+/K+-ATPasa disminuye con el tiempo de preincubación siguiendo una función exponencial simple. A una dada temperatura y composición del medio de preincubación, la disminución en la actividad Na+/K+-ATPasa es concomitante con la pérdida en la capacidad de ocluir Rb+ y del cambio detectado mediante fluorescencia intrínseca. Esta relación no se verifica cuando se estudia la estructura secundaria mediante dicroísmo circular evidenciando que la pérdida de actividad es debida a pequeños cambios en la estructura de la enzima. Los coeficientes de velocidad de inactivación (k), obtenidos a partir de medidas de actividad ATPasa aumentan drásticamente con el aumento de la temperatura siguiendo la relación prevista por la ecuación de Arrhenius. El estudio se completó caracterizando termodinámicamente el estado de transición de la inactivación térmica en cada una de las condiciones estudiadas. Con subsidios de UBA y ANPCyT