Estudio paralelo del cambio conformacional y la oclusión-desoclusión de Rb+ en la Na+/K+-ATPasa.

RODOLFO MARTIN GONZALEZ LEBRERO; MÓNICA R.MONTES; RODOLFO M GONZÁLEZ-LEBRERO; PATRICIO J. GARRAHAN; ROLANDO C. ROSSI.

Villa Carlos Paz, Córdoba, Argentina.

Congreso; XXXIV reunión anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB).; 2005

Sociedad Argentina de Biofísica

La Na+/K+-ATPasa acopla la hidrólisis de ATP al transporte de 3 iones Na+ y 2 iones K+ a través de la membrana plasmática. Durante su ciclo catalítico se verifican al menos los siguientes pasos 1- fosforilación de la enzima por ATP, 2- oclusión y desoclusión de los iones transportados y 3- transición entre los dos principales estados conformacionales E1 y E2.En un medio rico en Na+ o buffer simil-Na+ la ATPasa se encuentra en la conformación E1, en tanto en presencia de K+ prevalece la forma E2. En la enzima desfosforilada la liberación del K+ ocluido al lado citoplasmático se produce por el cambio conformacional de E2 a E1, paso que resulta reversible ya que la adición de K+ provoca la oclusión del mismo y la transición E1<->E2.El problema de cómo se relaciona la transición E1<->E2 con el transporte de los iones no ha sido totalmente resuelto. Una aproximación al problema, se puede realizar en principio simplificando el sistema, y analizando el comportamiento enzimático en un medio con Rb+ (congénere del K+) en ausencia de ATP de acuerdo al sig. esquema mínimo de reacción donde los paréntesis indican el Rb+ ocluído:       EsSQUEMA 1.En este sentido, analizamos en paralelo el cambio conformacional E1<-> E2 y la oclusión de Rb+, evaluando si son procesos simultáneos o si uno es anterior a otro y posteriormente el paso inverso, la desoclusión del Rb+ y la transición E2<->E1. Utilizamos la sonda fluorescente eosina‑Y para el seguimiento del cambio conformacional, ya que se une reversiblemente a la enzima con alta afinidad por E1 (aumento de señal fluorescente) y con baja afinidad a E2. Mediante una técnica de filtrado se determinó la oclusión o desoclusión de 86[Rb]Rb+ midiendo la aparición o disminución de la enzima con el cation ocluido. RESULTADOS. E1<-> E2 vs oclusión de Rb+. Se adicionó Rb+ en concentraciones entre 20 y 500 µM a la enzima marcada con eosina y se midió en el tiempo con un equipo de stopped flow la caída de la señal fluorescente (transición E1<-> E2) y con un equipo de mezclado rápido la formación del intermediario con Rb+ ocluido. En ambos casos fue insuficiente una ecuación monoexponencial para describir los datos obtenidos, lo cual sugiere que un solo paso no podría explicar la transición hacia el nuevo equilibrio. Observamos que si bien ambos fenómenos ocurren con una cinética muy similar, el tiempo de vida media del cambio conformacional es menor al de la oclusión de Rb+ y que esta diferencia se debe principalmente a que el cambio conformacional finaliza cuando un 20-30% de la oclusión aún resta por ocurrir. E2<-> E1 vs. desoclusión de Rb+. La enzima incubada con diferentes concentraciones de Rb+ (7 a 200 µM) fue mezclada en partes iguales con el buffer conteniendo eosina y 12 mM Na+. Las curvas normalizadas con respecto al cambio total de desoclusión de Rb+ y transción E2<->E1 resultaron idénticas a lo largo del tiempo a concentraciones de Rb+ iguales o mayores a 50 µM sugiriendo simultaneidad entre la liberación del catión y el pasaje E2<->E1. A concentraciones menores a 50 µM se observa en la curva del cambio fluorescente un componente rápido que no aparece en la desoclusión de Rb+. Esta fase brinda información sobre la proporción de la enzima que se une rapidamente a eosina y su amplitud, que disminuye con [Rb+] sería una estimación de la cantidad de E1 en el equilibrio inicial. Con subsidios de Conicet, ANPCyT y Universidad de Buenos Aires.