Caracterización cinética de un posible intermediario de transporte de Ca2+ en la Ca2+-ATPasa de membrana plasmática expresada en un sistema de Baculovirus.

M. FERREIRA GOMES; MC DE LA FUENTE; RM. GONZÁLEZ-LEBRERO; RC. ROSSI; JPFC ROSSI

Mar del Plata, Buenos Aires

Congreso; LII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica y Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Fisiología; 2007

La existencia de un gradiente de potencial electroquímico para el Ca2+ en las células, permite que el flujo de este ión en respuesta a señales extracelulares se constituya en un segundo mensajero. La bomba de Ca2+ de membrana plasmática (PMCA) es fundamental para el mantenimiento de este gradiente.La PMCA es una P-ATPasa cuyo mecanismo catalítico consiste en un ciclo de reacciones que involucran transiciones conformacionales, tanto en las formas fosforiladas (E1P->E2P) como en las desfosforiladas (E1->E2). En el proceso de transporte de Ca2+, este ión se une a sitios citoplasmáticos de la enzima (E1) para luego ser liberado en la transición E1P->E2P. Se postula que la fosforilación de la enzima sería simultánea con la oclusión de Ca2+.Hemos desarrollado una metodología para medir el estado ocluído del Ca2+ a partir de la sobreexpresión de la proteína en Baculovirus, que permite obtener preparaciones microsomales enriquecidas en distintas isoformas tanto fisiológicas como patológicas de la PMCA. Determinamos la oclusión Ca2+ mediante la combinación de un aparato de mezclado rápido y una cámara de filtración con un tiempo de resolución de 3.5 ms. La unión de Ca2+ se midió en presencia o ausencia de 2 mM o 25 mM ATP, 37.4 μg/ml de proteína, 100 mM (45Ca)Ca2+, 3 mM Mg2+ y con y sin 50 mM LaIII .La unión de Ca2+ en función del tiempo presentó un comportamiento bifásico: una primera fase rápida (180 ms) que estaría describiendo el proceso de oclusión; y una segunda fase lenta que representaría la acumulación de Ca2+ dentro de las vesículas. En conclusión nuestros resultados preliminares indican que la metodología implementada permite medir la desaparición transitoria del catión durante el transporte a través de la membrana. Esto permitirá el estudio de diversas isoformas de PMCA y postular el mecanismo detallado del transporte de calcio a través de la membrana.Con subsidios de ANPCYT, CONOCET y UBACYT