Hidrólisis de ATP por la Na+,K+-ATPasa en condiciones de “single turnover”.

J. MATÍAS STOPIELLO; SB. KAUFMAN; RODOLFO M GONZÁLEZ LEBRERO

Congreso; XL reunión anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2011

Sociedad Argentina de Biofísica

<!-- @page { margin: 2cm } P { margin-bottom: 0.21cm } --> La bomba de sodio-potasio (Na+,K+-ATPasa) es una proteína integral de membrana de células eucariotes que exporta tres Na+ desde el interior celular e importa dos K+ desde el medio extracelular empleando como fuerza impulsora la energía libre de la reacción de hidrólisis de ATP. El ciclo de trabajo de la Na+,K+-ATPasa se inicia con la unión de una molécula de ATP y tres iones Na a la bomba. Se produce luego la hidrólisis de ATP que rinde ADP y ortofosfato y este último fosforila la enzima en su conformación E1 (E1P). Un cambio conformacional ulterior transforma el intermediario E1P en E2P que, en ausencia de K+, se desfosforila espontáneamente liberando ortofosfato (Pi) y recuperando su conformación E1. Se completa así el denominado ciclo de reacción de la Na+-ATPasa. Al menos dos de los pasos de esta secuencia de reacciones son objeto de múltiples controversias: la unión de ATP en presencia de Mg2+ y la reacción de interconversión entre E1P y E2P. Con el propósito de obtener las constantes de velocidad que caracterizan ambas etapas del ciclo realizamos experimentos midiendo el curso temporal tanto de la liberación de Pi como de la cantidad de fosfoenzima durante la hidrólisis de ATP del ciclo de la Na-ATPasa. Dichos experimentos fueron realizados variando las concentraciones de enzima y ATP, pero en todos los casos con exceso de enzima respecto del sustrato (“single turnover”). Observamos que la cantidad de Pi medido como función del tiempo aumenta monoexponencialmente en todas las condiciones ensayadas. La constante aparente de dicha exponencial aumentó linealmente con la concentración de enzima (1,3–31,7 nM) y resultó independiente de la concentración de ATP. Esto indica que en las condiciones experimentales ensayadas la reacción de hidrólisis progresa bajo condiciones de pseudo primer orden respecto de la enzima. Por otro lado, la cantidad de fosfoenzima medida como función del tiempo aumentó hasta alcanzar un máximo para luego decrecer hasta valores distintos de cero. Estas curvas presentan la forma característica de intermediarios de reacción en un mecanismo de reacción consecutivo. Estos resultados indican que la estrategia experimental adoptada posibilita estudiar la secuencia de reacciones de la Na+-ATPasa y obtener las constantes de velocidad que lo caracterizan.