Utilización de 1H-RMN para la determinación de compuestos del metabolismo primario en ejes embrionarios de maíz.

LB PENA; CJ MORATTO; M PAVONI; M ARAN; SM GALLEGO

CABA

Encuentro; CaracterizAR 2020. 1er Encuentro Virtual destinado a la Caracterización de Materiales; 2020

FFyB (UBA) IQUIMEFA (CONICET)

El análisis del perfil de metabolitos de bajo peso molecular en mezclas biológicas complejas permite conocer el resultado final de la expresión génica de un organismo en un momento particular. En nuestro caso, nos permite obtener valiosa información del desvío del metabolismo que se produce en plantas sometidas a condiciones ambientales desfavorables para su crecimiento. El presente estudio se llevó a cabo para evaluar esta diferencia en la composición de metabolitos hidrofílicos producida en ejes embrionarios de maíz por su exposición durante 24 h a 10 μM CdCl2 (Cd), 0,5 μM metilvilógeno (MV) o 1 mM H2O2 utilizando espectroscopia RNM. Los ejes embrionarios de maíz luego de los tratamientos se molieron en N2 líquido y los metabolitos se extrajeron agregando metanol pre-enfriado. Luego de agitar y centrifugar se separaron los sobrenadantes y secaron en un evaporador rotatorio de vacío. El residuo se reconstituyó en una solución de fosfato de sodio conteniendo el estándar 3-trimetilsilil- [2,2,3,3-2H4]-propionato (TSP-d4) (D2O, pH = 7.4). Los espectros de 1H-RMN 1D se adquirieron usando un programa Bruker 1D NOESY estándar (Figura 1). Figura 1. Espectro típico 1H-RMN de 600 MHz de extractos metanólicos de ejes embrionarios de maíz. Los espectros fueron referenciados a la señal del TSP-d4 (1H δ = 0 ppm), se eliminó la señal del agua y se corrigió la línea de base. Para la asignación de las resonancias se utilizaron las bases de datos HMDB y BMRB. Todas las asignaciones fueron confirmadas mediante espectros bidimensionales, incluyendo 1H-13C-HSQC y 1H-1H-TOCSY. Para el análisis multivariado se utilizó MetaboAnalyst 4.0. La técnica implicó una preparación de muestra simple, con un alto rendimiento. Los datos obtenidos corresponden a cinco repeticiones de tres ensayos independientes. Se identificaron un total de 28 compuestos en las muestrasde los ejes embrionarios, incluidos principalmente aminoácidos, ácidos carboxílicos y carbohidratos. Además, se observaron resonancias asignadas a compuestos fenólicos no identificados. Las diferencias entre tratamientos se muestran en la Figura 2. Figura 2: Mapas de calor de metabolitos polares combinados con análisis de agrupamiento jerárquico. Tratamientos: Cd (10 μM), MV (0.5 μM) y H2O2 (1 mM)