IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTO INBIHIBIDOR DE XANTINA OXIDASA MEDIANTE ALGORITMO APLICADO A BIOAUTOGRAFIA ENZIMATICA ACOPLADA A EMAR

GARCIA, P; RAMALLO, IA; SALAZAR, MO; FURLAN, RLE

Los Cocos

Congreso; Segundo Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2013

Sociedad Argentina de Espectrometría de Masas

La enzima xantina oxidasa (XO) cataliza la oxidación de xantina a ácido úrico, generándose además especies reactivas de oxígeno (EROs): O2.- y H2O2. El exceso de ácido úrico lleva a la formación de depósitos de cristales en articulaciones y riñones. Niveles elevados de EROs están implicados en desórdenes vasculares: aterosclerosis, hipertensión, daño por isquemia-reperfusión.1 La inhibición de XO representa una de las formas de afrontar estas patologías. Con el fin de hallar nuevas moléculas activas, se evaluó la capacidad inhibitoria de XO de 37 aceites esenciales modificados (AEMs), mediante un ensayo autográfico de XO en gel de agar.2 Los AEMs se obtuvieron mediante reacción de bromación3 de sus respectivos aceites esenciales naturales. Del análisis de estas mezclas se detectaron más de un centenar de halos de inhibición. Este alto número de potenciales compuestos bioactivos crea la necesidad de aplicar metodologías que permitan acelerar su identificación, como es el caso de BIOMSID. Esta metodología, aun en desarrollo, combina la habilidad de la bioautografía en gel para detectar inhibidores presentes en mezclas, con la capacidad de la espectrometría de masas de alta resolución (EMAR) para identificar moléculas a través de sus fórmulas moleculares. Por lo tanto permite establecer rápidamente una conexión entre actividad inhibitoria de XO y la fórmula molecular del compuesto activo. BIOMSID, se basa en que la composición química no vinculada con la bioactividad en un halo de inhibición puede ser distinta en CCDs de la misma muestra realizadas con distintos sistemas de solventes. La comparación entre espectros de masa de dichos halos, utilizando un algoritmo escrito en MATLAB, permite la identificación del/los compuesto/s activo/s, ya que revela los iones comunes a todos los espectros. Esta estrategia se aplicó al AEM de Foeniculum vulgare Mill, el cual presentó uno de los halos más interesantes. Para tal fin, tres CCDs del AEM de F. vulgare, desarrolladas con diferentes solventes, fueron reveladas autográficamente para XO. De cada placa, se tomaron muestras del gel de agar del halo de inhibición, y de la matriz coloreada. Se adquirieron los espectros respectivos, los que se procesaron con BIOMSID. En una primera etapa, el algoritmo filtró las señales no relacionadas con la composición química del halo (buffer, reactivo revelador, sustrato), luego comparó los espectros filtrados detectando las señales comunes a todos ellos. De esta manera se identificaron dos valores de m/z para el halo de inhibición: m/z=243,0015 [M+H]+ y m/z=264,9835 [M+Na]+ verificados para la fórmula molecular C10H11BrO2. Se realizó el aislamiento de dicho compuesto mediante cromatografía en columna, y se elucidó su estructura utilizando RMN de 1H, 13C, HH COSY, HSQC y HMBC. La molécula responsable de la actividad es el 2-bromo-1-(4-metoxifenil) propan-1-ona, un derivado del anetol producto de la reacción de bromación que tiene la fórmula molecular propuesta. Este trabajo ilustra la factibilidad de asignar fórmulas moleculares a compuestos activos presentes en mezclas complejas directamente desde bioautografía, aplicando un algoritmo que ha demostrado ser robusto para EMAR. Referencias: 1- Borges, F; Fernandes, E; Roleira, F. Curr Med Chem 2002, 9, 195. 2- Ramallo, IA; Zacchino, SA; Furlan, RLE. Phytochem. Anal. 2006, 17, 15. 3- Mendez, L; Salazar, MO; Ramallo, IA; Furlan, RLE. ACS Comb. Sci. 2011, 13, 200