BIOMSID: IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS ACTIVOS MEDIANTE BIOAUTOGRAFÍA ACOPLADA A EMAR

RAMALLO, IA; SALAZAR, MO; FURLAN, RLE

Los Cocos

Congreso; Segundo Congreso de Espectrometría de Masa; 2014

Sociedad Argentina de Espectrometría de Masas

Se presenta BIOMSID,1 una estrategia para la identificación de inhibidores enzimáticos que combina la habilidad de la bioautografía para detectar in situ inhibidores en mezclas complejas, con la capacidad de la espectrometría de masas de alta resolución (EMAR) para determinar fórmulas moleculares. Así, se establece una rápida conexión entre actividad inhibitoria y la identidad del compuesto activo. En una primera etapa se separa la muestra por CCD y se revela bioautográficamente. Luego, se toman muestras de la zona de inhibición (halo) y de la matriz coloreada (control), y se adquieren los espectros de EMAR. Por último se procesan los espectros mediante un algoritmo en MatLab, que detecta cuáles señales corresponden al compuesto activo. El método se basa en que la composición química no vinculada con la bioactividad en un halo puede ser distinta en CCDs de la misma muestra con distintas fases móviles. Siendo así, la comparación entre espectros permite la detección de iones comunes, y por lo tanto la identificación del compuesto activo. La puesta a punto se realizó en torno a la búsqueda de inhibidores de acetilcolinesterasa (AChE), blanco para el tratamiento de Azheimer.2 Con el fin de facilitar la extracción de los compuestos, se desarrolló un ensayo bioautográfico mediante inmovilización de AChE en agar. El algoritmo desarrollado para la etapa de análisis se basa en dos parámetros: % de filtro (%F) y tolerancia (Tol). El %F define la intensidad por encima de la cual se toma en cuenta a una señal para el cálculo. La Tol define el rango m/z dentro del cual se asume que dos valores son iguales. La rutina consiste en: 1) filtrar el espectro del halo A y su control con un valor %F; 2) restar el control A filtrado al halo A filtrado; 3) repetir los pasos 1 y 2 con los halo/control B y C; 4) identificar los valores de m/z comunes en los sets A, B y C. La utilidad de la estrategia se demostró con un extracto de Brassica rapa ?pinchado? con 0.1% p/p de eserina (inhibidor de AChE3). Se realizaron en paralelo 3 experimentos de CCD desarrollados con diferentes solventes que se revelaron bioautográficamente. Por cada placa se tomaron 2 muestras de gel (halo y control) que se extrajeron con DCM y se analizaron por EMAR utilizando el algoritmo. En una primera etapa, el algoritmo filtró señales no relacionadas con la actividad (buffer, revelador, sustrato). En una segunda etapa, se compararon los espectros filtrados detectando dos señales comunes que se correspondieron con eserina. (C15H21N3O2): 276,1702m/z [M+1]+ y 298,1524m/z [M+Na]+. La metodología se aplicó también para analizar el extracto metanólico de Ilex paraguariensis, revelando dos valores pertenecientes al compuesto activo: 195.0878 m/z [M+H]+ and 217.0700 m/z [M+Na]+. Los mismos son iones relacionados a la fórmula molecular C8H10N4O2 perteneciente a cafeína, cuya presencia se ha reportado en la especie.4 El desarrollo de un ensayo simple y cálculos estratégicos facilitan la determinación de las fórmulas moleculares de compuestos bioactivos presentes en una mezcla compleja, incluso cuando son constituyentes minoritarios. BIOMSID podría aplicarse para analizar cualquier tipo de extracto activo, frente a diferentes blancos biológicos. En toxicología, sería aplicable para análisis dirigido por efecto.