Purificación parcial de una enzima fibrinolítica producida por Bionectria sp. LY 4.1 en condiciones de cultivo sumergido optimizado

CARO FC; PERALTA MP; DELGADO OD; FARIÑA JI

Lima

Congreso; IX Congreso Latinoamericano de Micología; 2017

Asociación Latinoamericana de Micología

Las enzimas fibrinolíticas son proteasas que degradan fibrina, la proteína principal que forma los coágulos sanguíneos y cuya acumulación descontrolada conduce a trombosis y diversas enfermedades cardiovasculares, incluyendo infarto agudo demiocardio. Se han realizado diversos estudios en busca de nuevos agentes trombolíticos a partir de bacterias, algas, plantas, gusanos, veneno de serpiente, insectos y hongos. Estos últimos mostraron ser una opción prometedora para la producción de enzimas fibrinolíticas, ya que las producen en cantidades significativas y principalmente de forma extracelular, lo que facilita su extracción/purificación. Estudios precedentes nos permitieron seleccionar a Bionectria sp. LY 4.1 como productor de enzimas con actividad fibrinolítica, y dicha capacidad pudo ser escalada a biorreactor con un medio de cultivo optimizado (MOPT) y bajo condiciones operativas seleccionadas para este fin. En este trabajo se avanzó en la purificación de la enzima mediante precipitación fraccionada a partir del extracto crudo enzimático (ECE) conteniendo actividad fibrinolítica, el que fue obtenido a partir del caldo de cultivo de Bionectria sp. LY 4.1 bajo condiciones optimizadas. Se utilizaron distintos volúmenes (2 y 4 volúmenes) de acetona en frío (-20°C) como agente precipitante. El precipitado recuperado (10000 × g / 30 min / 4°C) fue resuspendido en un pequeño volumen de buffer Tris-HCl 50 mM pH 7,8. Se corrieron dos geles nativosen paralelo (ND-PAGE), uno para determinar el perfil proteico de las muestras a lo largo del proceso de purificación/concentración y otro, para realizar un zimograma que revele las bandas con actividad fibrinolítica. Adicionalmente, a cada una de las fracciones se les determinó concentración de proteínas y actividad fibrinolítica para calcular actividad específica, factor de purificación y porcentaje de recuperación. Los resultados indicaron la conveniencia de precipitar las enzimas fibrinolíticas con 2 volúmenes de acetona, ya que esto condujo a un valor de actividad específica más elevado. Acorde a esta metodología, la enzima fue purificada 35 veces con un porcentaje de recuperación del 89%. Aunque esto representaría una etapa preliminar, la que será complementada con posteriores técnicas cromatográficas, los geles desnaturalizantes (SDS-PAGE) de la enzima parcialmente purificada revelaron una banda única de peso molecular relativo de ~21 kDa.