Evaluación del rol del sistema de secreción tipo vi en los procesos de movilidad y formación de biopelículas de Azospirillum brasilense Az39.

CONIGLIO, ANAHÍ; RIVERA, DIEGO; MOLINA, ROMINA; CASSÁN, FAABRICIO

Buenos Aires

Congreso; III Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental.; 2015

Asociación Argentina de Microbiología

El sistema de secreción tipo VI es el último descripto en bacterias gramnegativas. Es un complejo proteico anclado entre ambas membranas y relacionado con un gran número de procesos biológicos ligados al estilo de vida bacteriano o a la interacción célula-célula. Azospirillum brasilense Az39 es una de las cepas más utilizadas en la formulación de inoculantes para no-leguminosas en Argentina desde hace mas de 40 años. El análisis in silico de su genoma ha demostrado que contiene todos los genes necesarios para la síntesis y ensamblado del sistema secreción del tipo VI (SST6) aunque todavía se desconoce cuáles serian los procesos biológicos ligados al estilo de vida que dependerían del sistema de secreción esta bacteria. Con el fin de caracterizar y evaluar in vitro la funcionalidad del SST6 en A. brasilense Az39, se obtuvo por mutagénesis sitio-dirigida una cepa deficiente en la biosíntesis de la proteína del tubo denominada Hcp (Az39 ΔHcp) y se evaluó su comportamiento en relación con la cepa salvaje sobre la movilidad, como "swimming" y "swarming" y a nivel de la capacidad de producir biopelículas. A nivel de la producción de biofilms se utilizó la técnica de cristal violeta. Para ello, cultivos puros de ambas cepas en fase exponencial fueron utilizadas para inocular al 1 % (v/v) tubos de hemolisis conteniendo 1300 μl de medio Luria Bertani (LB) que fueron incubados a 37 °C y sin agitación por 48, 72 y 96 horas. En cada punto de la curva se descartó el medio y se enjuagó por triplicado con solución fisiológica estéril. Luego, se agregaron 1300 μl cristal violeta al 0,1 % (p/v) y se incubó durante de 15 m a temperatura ambiente. Se removió el indicador y se lavó 3 veces. Finalmente se adicionaron 1300 μl de etanol al 95 % (v/v) y se midió por espectrofotometría a DO560. Para el análisis de movilidad, se utilizó un medio de cultivo conteniendo bacto-triptona y agar al 0,3 % (p/v) para el caso de "swimming" y al 0,7 % (p/v) para "swarming". En el centro de las placas se colocó de manera individual, 1 μl de cada cultivo bacteriano en fase exponencial y se incubó a 30 °C durante 72 h por triplicado. Transcurrido el tiempo se midieron los halos de difusión para cada cepa. Nuestros resultados indican que la producción de biopelículas en la mutante Az39 ΔHcp fue significativamente menor que en caso de la cepa salvaje y así mismo para todos los puntos evaluados. Por otro lado, a nivel de la movilidad por "swimming" si bien ambas cepas lograron desplazarse en el medio de cultivo, la movilidad de la mutante fue mayor que en el caso de Az39. Finalmente, a nivel de la movilidad por swarming, no se observó desplazamiento en ninguno de los casos. Estos resultados sugieren que el SST6 de A. brasilense Az39 estaría involucrado en la interacción célula-célula, modificando su capacidad de adhesión intercelular y afectando así los procesos de formación de bio-películas y movilidad dependientes de swarming.