INVESTIGADORES
CASSAN Fabricio Dario
congresos y reuniones científicas
Título:
Estandarización de un método para la cuantificación de ácido-indol-3-acético en formulaciones de Azospirillum brasilense.
Autor/es:
CASSÁN, FABRICIO; MOLINA, ROMINA; OBANDO, MELISSA; TORRES, DANIELA; RIVERA, DIEGO
Lugar:
Córdoba
Reunión:
Jornada; XV Jornadas Argentinas de Microbiología. Adelantos en el diagnóstico Microbiológico.; 2014
Institución organizadora:
Asociación Argentina de Microbiología
Resumen:
El uso de bacterias
promotoras de crecimiento [PGPR] se ha convertido en una alternativa biotecnológica
para optimizar la producción de cultivos. Actualmente, el análisis funcional de
la producción de fitohormonas por PGPR y su regulación en plantas superiores ha
resurgido debido a los espectaculares avances en la integración de los modelos
de estudios bioquímicos, fisiológicos y moleculares. Es por ello que miembros
del género Azospirillum han
proporcionado un excelente modelo experimental para investigar y comprender el
papel fisiológico y molecular de auxinas sobre el crecimiento de las plantas. Debido
a esto, se hace necesario estandarizar un método simple, efectivo y
reproducible para la cuantificación de ácido-indol-3-acético en formulaciones de
Azospirillum sp. Por esta razón, el
objetivo del trabajo fue la validación del procedimiento colorimétrico de cuantificación de auxinas propuesto por
Salkowsky en formulaciones de A. brasilense. Para
generar la propuesta, se partió de información preliminar, obtenida por nuestro
grupo o por otros a nivel mundial: (1) la mayor proporción de auxinas que
produce Azospirillum brasilense en
presencia de L-triptofano [su precursor natural] son del tipo
ácido-indol-3-acético [AIA], siendo las otras extremadamente minoritarias en
esta relación. Esto determina que se encuentren casi por debajo del límite de
detección del método colorimétrico y en algunos casos de ciertos métodos
cromatográficos; (2) la cantidad de AIA producida por este microorganismo se
ubica entre 10-50 µg.ml-1 y está dentro del rango de detección del
método. Adicionalmente, tiene poca variabilidad entre cepas o especies de este
género; (3) existe una fuerte correlación entre los resultados obtenidos por la
metodología propuesta, con otras metodologías de mayor complejidad, tales como
la cromatografía líquida [HPLC], gaseosa [GC] o aquellas acopladas a espectrometría
de masas [MS]. Sobre la base de estas consideraciones hemos validado esta
propuesta experimental sobre la base de una innumerable cantidad de muestras experimentales
durante más de 5 años de trabajo y sobre la correlación con metodologías de
mayor complejidad. Se toman 1000 µl del cultivo bacteriano y se colocan en un
tubo plástico del tipo eppendorf de 1,5 ml de capacidad. Se centrifugan a 10.000
rpm por 10 m y opcionalmente se filtran [0.2 µm]. Se toman 500 µl del sobrenadante
y se mezclan con 500 µl del reactivo de Salkowsky [7.9 M H2SO4 y
12,5 g/L FeCl3] agitando 10 veces en
forma de inversión y suavemente. Se incuban por 30 minutos en completa
oscuridad y se mide la absorbancia en un espectrofotómetro a 530 nm. Con los datos de absorbancia se
obtiene un promedio de 3 réplicas de la muestra [réplica experimental] y 3 réplicas
del tratamiento [réplica biológica] y se hace el cálculo de concentración por
el uso de la ecuación obtenida de una curva patrón obtenida con soluciones
entre 0.1- 50 mM de AIA puro. La concentración de AIA deberá expresarse en μg.ml-1.