Characterization of the acil-homoserine lactone degradation by Azospirillum brasilense Az39

NIEVAS, SOFÍA; LÓPEZ, GASTÓN; GUALPA, JOSÉ; MOLINA, ROMINA; CONIGLIO, ANAHÍ; MORA, VERÓNICA; CASSÁN, FABRICIO

Córdoba

Congreso; IV Reunión conjunta de Sociedades de Biología de la República Argentina. XXIII Reunión de la Sociedad de Biología de Córdoba.; 2020

Sociedad de Biología de Córdoba

A. brasilense Az39 es una cepa que promueve elcrecimiento y aumenta el rendimiento de cultivos de interés nacional, talescomo trigo, maíz y sorgo, mayoritariamente a través de la fijación de nitrógenoy principalmente fitoestimulación. Si bien se han estudiado en detalle aquellosmecanismos relacionados con la promoción del crecimiento, sabemos poco sobrelos mecanismos que rigen la interacción bacteria-bacteria y en particularaquellos mediados por quórum. En nuestro laboratorio, hemos confirmado que Az39no produce moléculas del tipo acil-homoserín lactonas oAHLs (quorum sensing) pero las degrada (quorum quenching) debidoa una actividad enzimática. El objetivo de este trabajo fue determinar el tipode enzima involucrada en la degradación de AHLs en Az39 y verificar sulocalización celular. Inicialmente analizamos si la inactivación de AHLs sedebía a la presencia de enzimas del tipo lactonasas y para ello cultivamos labacteria en 5 ml de medio MMAB suplementado con 10 µm de AHLs (C6-HSL YC10-HSL) durante 16 h a 240 rpm, 30°C y pH 6.5-7.0. Transcurrido el tiempo deincubación, se tomó 1 ml del cultivo y se adicionó HCl 1 M hasta lograr un pH2.0, finalmente se tomaron muestras de 5 µl de cada mezcla de reacción ya diferentes intervalos de tiempo (5, 30 y 60 min) para ser analizadas porbioensayos con cepas reporteras. Para determinar la localización de la enzima,algunos tratamientos se pre-incubaron con diferentes AHLs, como se describió.Los tratamientos realizados a posteriorise detallan a continuación: (T1) LB + 10 µM de cada AHL; (T2) sobrenadantefiltrado de Az39; (T3) sobrenadante desnaturalizado y filtrado de Az39; (T4)Az39 desnaturalizado (100 °C- 30 min) y (T5) Az39. Todos los tratamientosfueron analizados mediante el uso de cepas reporteras. Finalmente, para laidentificación del gen responsable de la actividad de degradación de AHLs enAz39, se obtuvo una cepa mutante insercional para un gen putativo. Nuestrosresultados no evidenciaron re-lactonización de AHLs luego del tratamiento ácidopor lo que se descartó la participación de lactonasas en la inactivación deestas moléculas de señalización intercelular por Az39. Por el contrario, losensayos de desnaturalización permitieron sugerir que la enzima responsable dela actividad acilasa podría estar ligada a la membrana plasmática o ser denaturaleza periplasmática. La cepa mutante en un gen anotado por homología desecuencia como una penicilin acilasaputativa (EC. 3.5.1.11) fue incapaz de degradar AHLs sintéticas in vitro. Estos resultados confirman queA. brasilense Az39 no produce AHLspero las degrada a través de la expresión de un gen que codifica para unaenzima del tipo acilasa putativa y de localización celular.