Infección oral de larvas de insecto con baculovirus recombinante para la producción masiva de proteínas

ROMERO, LUCÍA VIRGINIA; LOPEZ, MARÍA GABRIELA; NAVARRO DEL CANIZO, AGUSTIN A.; TABOGA, OSCAR; CASCONE, OSVALDO; MIRANDA, MARÍA VICTORIA

Buenos Aires

Jornada; JorFyBi 2007; 2007

Sociedad Argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial

  INTRODUCCION Y OBJETIVO: La utilización de larvas de Lepidópteros como biofábricas permite obtener altos niveles de proteínas recombinantes a bajo costo. Las larvas de Rachiplusia nu son susceptibles a la infección con el virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV), pudiéndose infectar inyectando virus brotado en hemolinfa o por alimentación con poliedros. El sitio blanco de inserción del gen foráneo más comúnmente utilizado es el locus poliedrina. Durante la infección esta proteína se expresa mayoritariamente, y forma una malla proteica, denominada “poliedro”, que embebe a los viriones protegiéndolos de las radiaciones y la desecación. Como resultado del reemplazo alélico de este gen los baculovirus recombinantes con fenotipo occ- se caracterizan por no ocluirse en una matriz de poliedrina. Estos virus no ocluídos presentan una baja eficiencia de infección por vía oral en larvas de insecto. La infección oral es menos laboriosa, especialmente cuando se cuenta con un gran número de insectos. Se ha estudiado la expresión y purificación de peroxidasa de Armoracia rusticana (horseradish peroxidase, HRP C). El objetivo de este trabajo fue obtener poliedros mixtos para la infección oral de R. nu y producción de peroxidasa recombinante en hemolinfa.  MATERIALES Y METODOS: Se coinfectaron monocapas de células Spodoptera frugiperda (Sf9) (aprox. 7 x 105 cel/pocillo) con virus AcMNPV salvaje/ AcMNPV HRP+occ- a MOIs 1:1; 1:5; 1:10; 2:2; 2:10 y 2:20. Al 4º día postinfección, se colectaron y lisaron las células con SDS 0,5 %. El lisado fue centrifugado y el pellet resuspendido y tratado con DNAsa. El pellet obtenido fue resuspendido en NaCl 0,5 M y centrifugado nuevamente. Los poliedros purificados fueron cuantificados en una cámara de Neubauer. Larvas de R. nu del 4º estadío criadas individualmente a 23-25ºC fueron infectadas con una dosis de 1 x 106 pol/100 mg de dieta artificial. Al 4º DPI se recolectó hemolinfa determinándose la actividad de HRP en una mezcla conteniendo guayacol en buffer de  fosfatos 100 mM pH 7,4. La cinética enzimática fue monitoreada en 470 nm. La población viral tanto salvaje como recombinante fue cuantificada por Real Time PCR (RT-PCR), utilizando oligonucleótidos diseñados especialmente en el laboratorio. RESULTADOS: Comparando el nivel de expresión de poliedrina vs. peroxidasa obtenido puede estimarse que la población de virus salvaje es similar a la población de virus recombinante (SDS-PAGE). Sin embargo, el análisis por RT-PCR de los poliedros obtenidos con MOI 2:10 y 2:20 demuestran que la población recombinante es superior a la salvaje en dos órdenes de magnitud. A su vez se observa que la población de virus recombinante fue un orden de magnitud mayor en las relaciones de MOI 2:10 que en las 2:20. Esto último se refleja en la concentración de HRP recombinante alcanzada en ambas condiciones: 34,7 U/ml para MOI 2:10 y 32,2 U/ml para MOI 2:20. La relación virus salvaje/virus recombinante 2:10 resultó ser la más apropiada para obtener altos recuentos de poliedros y  la máxima expresión de la proteína de interés en larvas. CONCLUSIONES: Durante la coinfección a alta MOI, tanto el virus salvaje como el virus recombinante resultan co-ocluídos. Los poliedros mixtos pueden ser utilizados como inóculo para infectar eficientemente larvas por vía oral. Este esquema de trabajo puede aplicarse para la producción de otras proteínas de interés para la industria.