INVESTIGADORES
CAMPERI Silvia Andrea
congresos y reuniones científicas
Título:
Nuevas estrategias para el desarrollo de ligandos peptídicos por medio de bibliotecas combinatorias
Autor/es:
M. M. MARANI; M. C. MARTÍNEZ-CERON; S. L. GIUDICESSI; E. OLIVEIRA; R. ERRA BALSELLS; F. ALBERICIO; O. CASCONE; S. A. CAMPERI
Lugar:
Argentina
Reunión:
Simposio; XVI Simposio Nacional de Química Orgánica; 2007
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Investigación en Química Orgánica
Resumen:
La industria biotecnológica ha incrementado las proteínas terapéuticas en el mercado mundial. Sin embargo, sus elevados precios restringen su uso masivo. El 50-80% del costo total de producción es debido a su purificación. La cromatografía de afinidad (AC) es considerado el método más eficiente para el aislamiento y purificación de proteínas en mezclas complejas. Muchos procesos convencionales usan AC con anticuerpos monoclonales (mAbs) como ligandos por su alta afinidad y especificidad sin embargo, su alto costo dificulta su uso a escala industrial. Los péptidos cortos como ligandos en AC son ideales para la purificación de biofármacos por su fácil síntesis, estabilidad, selectividad y afinidad. La síntesis de bibliotecas combinatorias peptídicas permite obtener millones de péptidos facilitando el descubrimiento de ligandos adecuados. Dentro de las diferentes estrategias de construcción de bibliotecas peptídicas en fase sólida, el método dividir-acoplar-recombinar (DAR) es el más conveniente. Éste se basa en (i) dividir el soporte sólido en porciones iguales equivalentes al número de aminoácidos que se utilizarán en la construcción de la biblioteca, (ii) acoplar en cada porción un aminoácido diferente y (iii) mezclar las porciones. Esto asegura que todos los representantes de la biblioteca estén en igual proporción en la forma de una “una bolilla-un péptido” (en cada bolilla de resina habrá una única entidad peptídica). Hemos desarrollado una nueva estrategia de síntesis de bibliotecas combinatorias peptídicas que permite la fácil identificación de ligandos peptídicos para cualquier proteína de interés. Sobre la resina ChemMatrixR se inmovilizó ácido hidroximetilbenzoico (HMBA) y 5 residuos de gly. Sobre esta estructura se construyó por la química 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) una biblioteca combinatoria peptídica del tipo “una bolilla-un péptido” de la forma XXXXG5 siendo X= todos los aminoácidos naturales. Se eliminaron los grupos protectores de las cadenas laterales con TFA. Se realizó el screening de la biblioteca usando como proteína modelo estreptavidina marcada con ATTO-590 (colorante con fluorescencia roja). Para el análisis de los péptidos por MALDI se colocaron las bolillas (o secciones de las mismas) directamente en la placa del equipo y se clivaron con vapor de amoniaco. Para la elución de los péptidos se utilizó AcH/ACN/H2O. Se secuenciaron los péptidos por MALDI TOF-TOF utilizando como matriz ácido α-ciano-4-hydroxicinámico (CHCA). Las propiedades anfifílicas de la resina ChemMatrixR permitieron tanto la síntesis en solventes orgánicos como el screening en medio acuoso. El éster bencílico, que forma el HMBA con el primer aminoácido, es estable a piperidina y TFA  con lo cual se pudo elongar el péptido por la química Fmoc y remover los grupos protectores de las cadenas laterales con TFA sin liberar el péptido de la resina. Del screening con estrepatavidina-ATTO-590 se aislaron  40 bolillas con fluorescencia. La estabilidad de la resina ChemMatrixR a condiciones nucleofílicas permitió el clivaje del péptido con vapor de amoníaco. El clivaje no dejó contaminantes facilitando la posterior secuenciación del péptido. De las 40 secuencias obtenidas, la mayoría contuvo los aminoácidos Phe, Tyr, Leu e His, y la secuencia más repetida fue Leu-Leu-His-Tyr, que a su vez mostró alta afinidad por estreptavidina.
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