INVESTIGADORES
CAMPERI Silvia Andrea
congresos y reuniones científicas
Título:
Análisis directo de ligandos peptídicos por medio de MALDI-TOF-MS. Identificación de péptidos unidos a bolillas aislados de screenings de bibliotecas del tipo una bolilla-un péptido
Autor/es:
M. M. MARANI; E. OLIVEIRA; S. CÔTÉ; S. A. CAMPERI; F. ALBERICIO; O.CASCONE
Lugar:
Buenos Aires, Argentina
Reunión:
Congreso; XI Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial; 2007
Institución organizadora:
Asociación Argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial
Resumen:
INTRODUCCIÓN: Dado que el 50 al 80% del costo total de producción de proteínas  terapéuticas se debe al proceso de purificación y que la industria biotecnológica ha incrementado las proteínas farmacéuticas en el mercado mundial, es importante generar procesos de purificación cada vez más eficientes. La cromatografía de afinidad es el método más eficiente para el aislamiento directo y purificación de biomoléculas a partir de mezclas complejas. Los péptidos cortos son ligandos excelentes para las separación por afinidad: no causan respuesta inmune en caso de liberación al producto, son más estables que los anticuerpos a las condiciones de lavado y elución y presentan selectividad aceptable. La síntesis combinatoria de bibliotecas peptídicas permite obtener millones de péptidos facilitando el descubrimiento de ligandos adecuados para una proteína de interés. Luego del proceso y screening es necesaria la identificación del péptido-ligando. La alta sensibilidad de la espectrometría de masa, su exactitud, alta velocidad y gran cantidad de información generada la convierten en una técnica de elección para secuenciación de proteínas y péptidos. MATERIALES Y MÉTODOS: Sobre la resina ChemMatrixR se inmovilizó el linker HMBA y se sintetizó un brazo espaciador de 5 residuos de glicina empleando química Fmoc. Sobre esta estructura se sintetizaron por un lado péptidos controles (APARGGGGG, APARG, VGLVGGGGG, VGLVG -controles negativos- y FHPQGGGGG y FHPQG, GHPQGGGGG, GHPQ, WHPQGGGGG, WHPQG -controles positivos-) y por otro una biblioteca combinatoria del tipo XXXX (X= A, F, G, H, L, P, Q, R, V) utilizando el método de dividir-acoplar-recombinar.  Los grupos protectores de las cadenas laterales se eliminaron con TFA/TIS/H2O. El screening se llevó a cabo a temperatura ambiente utilizando estreptavidina unida a peroxidasa (Strept-POD) como sistema modelo para la selección de ligandos con afinidad a la misma. Para el análisis por MALDI se colocaron las bolillas (o secciones de las mismas) directamente en la placa del equipo y se clivaron con vapor de amoniaco en TFA (NH3/THF). Para la elución del péptido se utilizó AcH/ACN/H2O. Se ensayaron diferentes matrices para el MALDI. RESULTADOS: Las propiedades anfifílicas de la resina ChemMatrixR permiten tanto la síntesis con solventes orgánicos como el screening en medio acuoso. La unión del linker al primer aminoácido es estable tanto a las reacciones de elongación de la cadena peptídica como a la remoción de los grupos protectores de las cadenas laterales. Siendo vulnerable al clivaje con NH3/THF, permite la adaptación del método descrito por Bray et. al. al sistema propuesto. El screening de los péptidos controles demostró que la resina ChemMatrixR, el linker y el brazo espaciador de 5 residuos de no interfieren en la unión Strept-POD-ligando y no hay interacción inespecífica. La matriz CHCA es la más apropiada tanto para los ensayos de MS como los de MSMS. 26 bolillas de la biblioteca fueron seleccionadas al azar para su análisis por MALDI-TOF-MS demostrando muy buena reproducibilidad tanto si eran seccionadas en dos o en cuatro partes. La biblioteca fue sometida a screening con la Strept-POD aislándose 5 bolillas positivas. Se identificaron las secuencias HPQF (2 veces), FHPQ (dos veces) y LHPQ. Todas contienen HPQ, lo que concuerda con los resultados de Lam et. al., quien describió la alta afinidad de esta secuencia por la estreptavidina. CONCLUSIONES: Esta metodología permite una rápida identificación de péptidos en un corto tiempo, a un bajo costo y con una alta sensibilidad, permitiendo la generación de múltiples réplicas a partir de una bolilla lo que maximiza las chances de una identificación correcta del ligando inmovilizado en una bolilla de resina. Esto acelerará la identificación de ligandos peptídicos sintéticos de afinidad para la purificación de nuevos biofármacos introducidos por la industria farmacéutica.
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