ENSAYO DE ESTABILIDAD DE LIGANDOS CROMATOGRÁFICOS POR ESIMS

J. M. GUREVICH-MESSINA; S.A. FLOR; S. L. GIUDICESSI; S. A. CAMPERI

Rosario

Congreso; III Congreso Argentino de Espectrometrìa de Masa; 2016

Sociedad Argentina de Espectrometría de Masa

Los péptidos cortos pueden emplearse como ligandos para cromatografía de afinidad. A diferencia de los ligandos proteicos, los oligopéptidos son más estables químicamente y de menor costo. Recientemente diseñamos un péptido con afinidad por un biofármaco recombinante producido en células CHO para su uso como ligando de afinidad. Teniendo en cuenta que la matriz cromatográfica se utiliza para purificar directamente la proteína recombinante a partir del caldo de cultivo celular se evaluó la estabilidad del ligando frente a proteasas y peptidasas. Asimismo, para aumentar la estabilidad del ligando cromatográfico y, teniendo en cuenta que en general las proteasas son estereoselectivas, se modificó el ligando utilizando D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos. Para evaluar la estabilidad de los ligandos cromatográficos se utilizó espectrometría de masas.Se sintetizaron los ligandos peptídicos con D-aminoácidos o L-aminoácidos en fase sólida utilizando química Fmoc y la resina ChemMatrix con el ancla HMBA (ácido hidroxi metil benzoico). El primer aminoácido se unió así al ancla por una unión éster. Diferentes alícuotas de las resinas con los respectivos péptidos inmovilizados se incubaron paralelamente con soluciones de peptidasas y proteasas a 37°C y se tomaron muestras cada 1 h durante 16 h. Las muestras se lavaron con agua destilada, dimetilformamida y finalmente con diclorometano. Luego, se incubaron con vapor de amoníaco de manera de clivar la unión éster entre el péptido y en ancla de la resina. Se eluyó el péptido con una solución de H2O/acetonidrilo/ácido acético (3:4:3). De los eluídos se hicieron diferentes diluciones que fueron analizadas por espectrometría de masas utilizando un ESI-QqQ TSQ Quantum Access MAX (Thermo Scientific). El modo de inyección fue directa usando un loop de 20 µl y ácido acético (HAc) 0,1% como solvente. Se registraron los espectros en modo positivo Los péptidos que presentaron mayor estabilidad permanecieron intactos a lo largo de la incubación con las proteasas, mientras que los péptidos más sensibles fueron fragmentados y por ESI MS se visualizó el fragmento C-terminal de los péptidos separados de la resina. El rediseño de los péptidos utilizando D-aminoácidos en lugar L-aminoácidos incrementó considerablemente la estabilidad de los ligandos peptídicos manteniendo su afinidad por el biofármaco recombinante. La mayor estabilidad del ligando inmovilizado es ideal para aumentar la vida útil de la matriz cromatográfica de afinidad. El poder usar la resina cromatográfica por más ciclos favorece la reducción de los costos de producción, haciendo más rentable el proceso global.