Informe Técnico de Avance n.1-Generacion de un Protocolo (Kit) de Preparacion de Celulas Madre con Fines Terapeuticos con Reproducibilidad y Eficacia Terapeuticas Optimizadas.

MARCELA F. BOLONTRADE Y OSVALDO PODHAJCER

2009-01-01/2009-12-01

1-7

Informe Técnico de Avance de Instrumento de Agencia PICT

Prom.Gral.del Conoc.-Cs.Medicas

Se demostró recientemente que células adultas (especialmente fibroblastos y queratinocitos) son capaces de desdiferenciarse luego de ser modificadas genéticamente mediante el uso de al menos 3 genes definidos, generando las denominadas Induced Pluripotent Stem Cells (iPS) (Takahashi y Yamanaka 2006). Estas células tienen características similares a las células madre embrionarias ya que generan teratomas y pueden generar un animal mosaico si se las transfiere a un blastocisto. Por otro lado, estudios de los últimos dos años ponen dudas acerca de la real capacidad de las células mesenquimales de medula ósea (MSC-MO) de diferenciarse hacia neuronas o cardiomiocitos (Rose, Stem Cells 2008ª; Tropel, Stem Cells 2006). Estudios previos muestran que no todos los clones de iPS que se generan del mismo donante pueden luego diferenciarse en forma efectiva. Es por ello que mantenemos la idea de buscar una firma molecular predictiva tal cual estaba definido en el proyecto original; pero en este caso será predictiva de la capacidad de cada clon de iPS de diferenciarse hacia neuronas y cardiomiocitos. Tal cual se proponía en el proyecto original hemos comenzado a cultivar MSC de tejido adiposo (MSC-TA) principalmente porque el numero de células que se obtiene es mayor y no generan los problemas éticos de las MSC-MO ya que se trata de material de descarte. Las muestras provienen de lipoaspirados y/o de reducciones quirúrgicas bajo consentimiento informado. Hasta el momento recibimos 4 muestras, aisladas de acuerdo a un protocolo que estandarizamos en forma conjunta con los cirujanos que proveen las muestras; estas se caracterizaron de acuerdo a los criterios de definición de MSCs, demostrando positividad para marcadores de linaje mesenquimal (pe >90% CD90+) y ausencia de expresión de marcadores de linaje hematopoyético (<1% CD34 y CD45). Con esto comenzamos a generar un banco de MSC-TA desde la fracción cruda obtenida de la resección quirúrgica (Stromal Vascular Fraction, SVF) hasta pasaje 4. La estrategia implica tener un alto número de viales en pasajes bajos, de modo de poder recurrir a una muestra repetidas veces a lo largo del diseño experimental de generación de iPS. De acuerdo a la evolución de los marcadores de superficie desde el extracto inicial SVF, corroboramos que la presencia de MSC en el SVF varia entre un 10 y un 30% según la muestra, llegando hasta niveles de 90% de expresión de CD90 en pasajes mayores a 2. También confirmamos la capacidad de las MSC-TA de diferenciarse hacia los linajes osteogénico, adipogénico y condrogénico. El objetivo es obtener muestras de al menos 10 pacientes donde se pueda evaluar desde la obtención de iPS hasta la inducción de la diferenciación. También nos encontramos colaborando con el grupo de Fernando Pitossi en la caracterización de MSC de cordón umbilical como parte del afianzamiento de una plataforma común a estos dos proyectos que conforman el proyecto 1. Las iPS serán generadas a partir de una infección con un vector lentiviral, cedido por Gustavo Mostoslavsky (Sommer, Stem Cells 2010) que contiene los 4 genes humanos de reprogramación (Oct4, Klf4, Sox2 y cMyc). Ya hemos amplificado los plásmidos de empaquetamiento del lentivirus, HDM-VSV-G, Tat1b, Hgpm2 y RC-CMV Rev1b, así como el plásmido que contiene los LTR del virus y los 4 genes, llamado pHAGE-hSTEMCCA-loxp (así como una segunda versión conteniendo Luc-cherry en lugar de Myc). Este vector permite la expresión constitutiva de Oct4, Klf4, Sox2 y cMyc humanos y una escisión mediada por CRE cuando las iPS ya han sido generadas.