Informe Técnico de Avance 1_ Rol de Células Madre Adultas Mesenquimales Durante la Formación del Estroma Tumoral y su uso como Vehículo de Transporte de Genes Terapéuticos

MARCELA F. BOLONTRADE, OSVALDO PODHAJCER

2007-03-12/2008-04-15

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Informe Técnico de Avance- Agencia Nacional de Ciencia y Técnica

Prom.Gral.del Conoc.-Cs.Medicas

Hemos puesto a punto una metodología de aislamiento de subpoblaciones de MSCs de médula ósea. Esto es un avance ya que no existe consenso y existen variables no tenidas en cuenta en el momento de la obtención final del producto biológico. Hemos aislado dos subpoblaciones de MSCs denominadas MO y MO/SN, que se obtienen mediante la introducción de una modificación al protocolo convencional de aislamiento de MSCs; luego de someter la muestra a una centrifugación en gradiente de densidad y  obtención de capa mononuclear, la modificación consiste en retirar luego de 1 hora de plaqueo inicial de la capa de células mononucleares, el sobrenadante que contiene las células que no se han adherido inicialmente; éste sobrenadante es subplaqueado y origina la población MO/SN.   Las células que se adhirieron inicialmente en cultivo en presencia de suero durante la hora inicial comprende la población MO.  El aislamiento tradicional de MSCs se realiza utilizando las células adheridas a 72 hs post-plaqueo. Hemos logrado identificar actividades diferenciales de estas poblaciones mediante comportamiento migratorio frente a suero fetal bovino y medio condicionado de líneas tumorales de mama, y mediante un patrón de adhesión diferencial a matrices extracelulares en ensayos in vitro. Hemos identificado dos patrones migratorios frente a suero: en practicamente todas las muestras, salvo 1, se observo una mayor migracion de la subpoblación MO/SN.  En cuanto a la adhesión a matrices, la tendencia general en las muestras analizadas se corresponde con una mayor adhesion de la poblacion MO en presencia de fibronectina; el comportamiento frente a colágeno I de las muestras analizadas es mas variable, pero la tendencia indica una mayor adherencia tambien de la población MO.     Hemos puesto a punto la diferenciación de MSCs hacia el linaje condrogénico (previamente lo habíamos hecho hacia linaje osteocítico y  adipogénico). Esto es significativo ya que estos tres linajes constituyen uno de los hallmarks de celulas madre estromales de médula osea.  Ambas poblaciones, la MO y MO/SN son multipotenciales, es decir que son capaces de diferenciarse hacia los 3 linajes. Hemos ampliado nuestro banco de MSCs de médula ósea, lo cual nos permitirá realizar series de experimentos con la misma serie de muestras de MSCs médula. Los experimentos mencionados se han realizado sobre 9 muestras de MSCs (esto es, provenientes de 9 donantes distintos) de las cuales se pudieron aislar las subpoblaciones MO, MO/SN asi como tambien la poblacion standard de MSCs que se describe en la literatura general y que utilizamos como referencia experimental. En nuestro banco de MSCs contamos actualmente con 19 muestras. De estas, 5 muestras no comprenden las subpoblaciones MO y MO/SN debido a que las MO/SN no prosperaron, por lo tanto estas muestras no se utilizaron para los experimentos comparativos de MO y MO/SN. Parte de estas muestras no presentan un comportamiento proliferativo en cultivo que permita llegar a un número de células que permitan realizar los experimentos de migración y adhesión; de ahi que se hayan utilizado solo 9 muestras. Con estas 9 muestras podemos llegar a 2 - 7 subpasajes, que son los que se utilizan en los experimentos; durante la expansión celular realizada para llegar a un número celular que permita realizar un experimento, parte de las células se expanden para congelar y volver a ingresar al banco de MSCs, lo cual permite poder volver a ese stock celular para subsiguientes experimentos.