EL ESPERMATOZOIDE HUMANO COMO MODELO DE EXOCITOSIS: ESTUDIO DEL ROL DE ARF6 EN LA FUSIÓN DE MEMBRANAS.

PELLETAN, LEONARDO E; LOPEZ, CECILIA I; MAYORGA, LUIS S; BELMONTE, SILVIA A

Mendoza

Jornada; X JornadasVirtuales de Investigación- FCM ? 1º Mención Investigador Joven. Universidad Nacional de Cuyo.; 2008

Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Cuyo

EL ESPERMATOZOIDE HUMANO COMO MODELO DE EXOCITOSIS: ESTUDIO DEL ROL DE ARF6 EN LA FUSIÓN DE MEMBRANAS.Pelletán LE, Lopez CI, Mayorga LS y Belmonte SA. Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Instituto de Histología y Embriología (IHEM-CONICET). Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Cuyo, Mendoza, Argentina.La exocitosis acrosomal (EA) del espermatozoide es un requisito para la fertilización del ovocito. La RA es una exocitosis regulada por calcio donde la membrana acrosomal externa y el plasmalema fusionan en múltiples puntos. Este mecanismo comparte características con otros eventos de exocitosis regulada y por eso utilizamos esta célula como modelo para el estudio de diferentes aspectos de la secreción. Los mecanismos de transducción de señales que conducen a la EA indican que ZP3 y progesterona inducen un aumento bifásico de calcio intracelular en el espermatozoide. El primer incremento es causado por la apertura de canales de calcio sensibles a voltaje (VOCC), el calcio transiente activa una fosfolipasa C (PLC) que genera inositol 1,4,5-trifosfato (IP3),que activa la salida de calcio por los canales sensibles a IP3 acrosomales. Los canales operados por reservorio (SOCC) detectan la depleción de calcio acrosomal y producen un aumento sostenido de calcio citosólico que dispara la RA. Nuestro laboratorio desarrolló un protocolo para permeabilizar espermatozoides humanos. Los poros generados en la membrana plasmática simulan la apertura de los SOCCs lo que permite estudiar lo que ocurre luego de su apertura y también el libre ingreso de compuestos impermeables a membranas. Nuestros resultados preliminares indican que la exocitosis inducida por diacilglicerol (DAG), producto de la actividad de PLC, converge en la vía de transducción de señales de calcio y actúa luego de la apertura de los SOCCs. Además fosfolipasa D (PLD), ácido fosfatídico (PA) y fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) forman parte de la señalización que se activa después de la apertura de los SOCCs.Las proteínas Arf (factor de ribosilación de ADP) son GTPasas monoméricas de 20 kDa. Oscilan entre un estado activo unidas a GTP y uno inactivo unidas a GDP. Están miristoiladas en el residuo glicina N-terminal que permite su anclaje a membranas donde ejercen su función. Las Arfs modifican la composición lipídica y reclutan proteínas citosólicas a las superficies de las membranas. Arf6 regula el ensamble de los filamentos de actina, el reciclaje y la vía endocítica. Recientemente se descubrió su función en la exocitosis regulada.Se conoce que PLD y fosfatidilinositol 4-fosfato 5-kinasa (PI4P-5K) son efectores de Arf6. PI4P-5K cataliza la transformación de fosfatidilinositol 4-fosfato (PI4P) en PIP2. Quisimos investigar si Arf6 actúa regulando estos efectores durante la fusión de membranas. Por eso, el objetivo general fue determinar el rol de Arf6 en la exocitosis acrosomal de espermatozoides humanos; y nuestros objetivos específicos fueron: determinar si Arf6 está presente en espermatozoides humanos y definir su localización, producir y purificar Arf6 miristoilada recombinante y caracterizar la vía de señalización en la que interviene Arf6.Para dilucidar estos objetivos utilizamos: ensayos funcionales y bioquímicos en espermatozoides permeabilizados, electroforesis en geles de poliacrilamida, Western blot, inmunofluorescencia indirecta, producción de proteínas recombinantes y cromatografía de afinidad.RESULTADOS Y CONCLUSIONES: Como Arf6 se ancla a membranas a través del residuo miristoilo decidimos aislar membranas de espermatozoides humanos para estudiar si Arf6 se encontraba presente. Realizamos Western blot utilizando anticuerpos monoclonales anti-Arf6. Observamos una banda mayoritaria de 20 kDa, confirmando la presencia de Arf6 en membranas de espermatozoides humanos. Ensayos de inmunofluorescencia indirecta utilizando doble tinción nos permitieron determinar que Arf6 se encuentra en la región acrosomal de espermatozoides humanos intactos.Para estudiar la ubicación de Arf6 en la cascada de transducción de señales que conducen a la RA produjimos la proteína recombinante. Como la bacteria carece de actividad N-miristoiltransferasa, cotransformamos en E. coli BL21(DE3)pLysS los plásmidos pET21b-Arf6 y pBB131-NMT (codifica para N-miristoiltransferasa de levaduras). Así logramos un modelo de miristoilación de proteína eucariota en un sistema bacteriano. Se observó gran eficiencia en la producción y purificación de la proteína recombinante (E1-3, 20 kDa). Verificamos el grado de miristoilación de la proteína Arf6 con el método de tritón X-114. Este detergente es miscible en soluciones acuosas a 4ºC pero se separa en una fase acuosa y otra detergente a partir de los 20ºC. Las proteínas hidrofílicas quedan en la fase acuosa mientras que las que contienen residuos lipídicos quedan en la fase detergente. Demostramos que Arf6 está totalmente miristoilada ya que se encuentra en la fase detergente y Arf6 no miristoilada (usada como control) está en la fase acuosa.Para los ensayos funcionales en espermatozoides humanos permeabilizados utilizamos la proteína miristoilada y cargada con los análogos no hidrolizables de GTP y GDP, GTPgamaS y GDPbetaS respectivamente. Arf6 miristoilada y cargada con GTPgamaS indujo exocitosis acrosomal en un porcentaje similar al producido por calcio. Arf6 miristoilada cargada con GDPbetaS no disparó RA e inhibió la exocitosis inducida por calcio. Estos datos indican que Arf6 debe estar unida a GTP para inducir RA y que está involucrada en la vía de transducción disparada por calcio. Arf6 activada no necesita calcio citosólico para inducir exocytosis. Sin embargo, requiere la salida de calcio acrosomal ya que inhibidores de canales de calcio sensibles a IP3 (2-APB, xestospongina C) inhiben la RA disparada por Arf6. Además, para ser funcional Arf6 requiere estar miristoilada. Estos resultados indican que la función de Arf6 es necesaria para que ocurra la EA calcio dependiente.Para comprobar si Arf6 está actuando sobre PLD, probamos la función de la proteína recombinante en presencia del inhibidor de PLD (butan 1-ol). Butan 1-ol inhibe de la EA inducida por Arf6. Esta inhibición revierte adicionando PA sugiriendo que la exocitosis inducida por Arf6 requiere la activación de PLD1 y la presencia de PA.Utilizamos el dominio PH de PLCdelta4 que secuestra PIP2 endógeno para determinar si la función de Arf6 depende de PIP2. Este dominio inhibió la RA inducida por Arf6 activa. La inhibición se rescató agregando PIP2. Esto indica que PIP2 es requerido para que Arf6 induzca RA sugiriendo la participación de PI4P-5K.Nuestra hipótesis es que en espermatozoides humanos Arf6 regula la actividad de PLD que hidroliza fosfatidilcolina generando PA y también activa la PI4P-5K. PA también activa PI4P-5K amplificando el efecto de Arf6. Ambos efectos de Arf6 conducen al aumento del pool de PIP2, aumentando la concentración de IP3 para lograr la salida masiva de calcio acrosomal conduciendo a la exocitosis.