Inducción de mecanismos de defensa en papa

ANDREU A. B.

Balcarce

Jornada; VIII Jornadas Argentinas de Biología y Tecnología de Poscosecha; 2015

INTA

Debido a su naturaleza sésil, las plantas están constantemente sujetas a situaciones medioambientales adversas, debido a ello, han desarrollado mecanismos que les permiten subsistir cuando se presentan condiciones de crecimiento desfavorables. Entre los peligros más serios que deben afrontar se encuentran las infecciones por hongos, virus y bacterias. Es sorprendente constatar que, a pesar de su falta de movilidad y la ausencia de un sistema inmune, la muerte de las plantas por enfermedad termine siendo una situación excepcional. La protección inicial frente a una infección se logra mediante un desarrollado conjunto de mecanismos complejos para obstaculizar la entrada de los patógenos. La batería de reacciones incluye barreras físicas y químicas, tanto preformadas (constitutivas) como inducibles (activas), dependiendo sin son características pre-existentes de las plantas o se inducen frente a un ataque. La activación de la defensa supone la existencia de mecanismos de reconocimiento mediante los cuales la planta determina la presencia del patógeno para desarrollar la respuesta adecuada. Dependiendo del éxito de la infección se puede dar una interacción incompatible o compatible. En la primera la planta bloquea al patógeno inmediatamente después de su reconocimiento evitando la infección; mientras que en la segunda el microorganismo suprime o retrasa el reconocimiento por parte de la planta permitiendo la infección. Estas interacciones planta-patógeno son especificas e invariables.En el reconocimiento de la planta al patógeno, se requiere de un diálogo molecular entre los organismos involucrados, en los cuales se debe considerar el inicio cuando las plantas perciben a través de los ?Receptores de Reconocimiento? (PRRs, por sus siglas en inglés) que se encuentran a nivel de membrana, las moléculas derivadas de los microorganismos denominadas ¨Patrones Moleculares Asociados a Microorganismos o Patógenos¨ (PAMPs, por sus siglas en inglés). La unión de PAMPs con su respectivo PRRs desencadena aguas abajo una respuesta de defensa en la planta llamada ?Inmunidad? activada por PAMPs (PTI, por sus siglas en inglés). Durante la evolución biológica, los patógenos exitosos han desarrollado moléculas efectoras de virulencia, denominadas ?Efectores de Sensibilidad? (EST, por sus siglas en inglés), que les permiten para pasar por alto el sistema de defensa inicial en la planta, ya sea por la prevención de la detección por parte del anfitrión o mediante la supresión de la señalización de PTI, permitiendo así la virulencia del patógeno. Sucesivamente, la planta para combatir estos patógenos exitosos desarrolla una segunda línea de defensa mediada por proteínas de resistencia (R). Proteínas R reconocen el efector especifico del atacante (antes conocidos como Factores de Avirulencia), resultado en un inmunidad secundaría que se denomina ?Inmunidad Activada por Efectores? (ETI, por sus siglas en inglés).ETI es una manifestación de la clásica resistencia ?gen-por-gen? que es acompañada de una respuesta hipersensible (HR), la cual requiere de un una rápida producción de Especies Reactivas de Oxigeno (EROs) denominada como Estallido Oxidativo. La HR permite la programación de muerte celular que limita el acceso del patógeno, al agua y los nutrientes de la planta, permitiendo aislarlo y evitando el daño en otros sitios, esta resistencia se induce frente a patógenos biótrofos o hemi-biotrofos, lo cual previene la entrada del patógeno. Es por ello que, el resultado final depende de la capacidad del patógeno para suprimir el sistema inmunológico de la planta, y la capacidad de la planta para reconocer al patógeno y activar el sistema de defensa. Dicha señal resulta en un patrón, donde se activan un conjunto de genes y hormonas que actúan como señales relacionados con la defensa que finalmente determina la naturaleza y eficacia de la respuesta de defensa. Luego del reconocimiento del patógeno por PRRs, se activa una respuesta inmunológica donde participan las hormonas ácido abscísico (SA), ácido jasmónico (JA) y etileno (ET), las cuales son las más ampliamente estudiadas. Además, las hormonas giberelinas, auxinas y citoquininas; brasinoesteroides y óxido nítrico, han sido descriptos por su participación en la modulación de una respuesta de defensa. La implicancia de muchas moléculas con función de crecimiento y desarrollo, además de participar en las respuestas de defensa, sugiere que el control de la respuesta inmune está implicado en una compleja red de comunicación hormonal donde las vías se cruzan. El potencial de regulación de este tipo de respuesta es lo que le permite a la planta adaptarse rápidamente a un estrés biótico o abiótico.La activación de PTI y ETI en los tejidos infectados desencadena diferentes tipos de respuestas en los tejidos distales, que consisten en una o varias señales que se propagan a larga distancia con la finalidad de mejorar la capacidad defensiva en zonas aún no infectadas. Una de estas Resistencia Inducida (IR, por sus siglas en inglés) mejor caracterizadas, es la ?Respuesta Sistémica Adquirida? (SAR, por sus siglas en inglés), donde hay una activación rápida en el sitio de infección y una respuesta que lleva más tiempo en los tejidos distales. En los tejidos distales, SAR se caracteriza por el incremento de la hormona SA, por lo que esta hormona es una molécula marcadora de SAR.Además de la infección por patógenos, la colonización de las raíces por microbios benéficos estimula el sistema inmunológico de las plantas, dando como resultado un fenotipo similar de resistencia a un amplio espectro de patógenos, este tipo de resistencia se conoce como ?Respuesta Sistémica Inducida? (SIR, por sus siglas en inglés). Por otra parte, la herbívoria y productos químicos específicos pueden inducir resistencia. El JA y ET son hormonas que juegan un rol preponderante en este tipo de RI (Pieterse et al., 2012).Un tercer tipo de vía de señalización es el ?priming?. El mismo es un sistema de defensa que prepara mejor a la planta para combatir a los patógenos o ataque de insectos en tejidos distales, se caracteriza por una activación más rápida y más fuerte del sistema celular frente a un patógeno, dando como resultado un nivel de resistencia mayor. El priming es un proceso celular que involucra diferentes mecanismos de inmunidad sistémica o inducida químicamente, incluye así SAR, SIR y daño por herbivoría. Después de muchos años de investigación, la foto que está emergiendo sobre el estudio de las diferentes respuestas de resistencias inducidas indican que estas se regulan por una compleja red que presenta interconexiones de las vías de señalización donde las hormonas vegetales desempeñan un importante papel regulador. Las hormonas proporcionan a las plantas un enorme potencial de regulación para adaptarse rápidamente a su medio biótico e utilizar sus limitados recursos para el crecimiento y la supervivencia de manera eficiente. Gran parte de estos mecanismos de defensa involucran la activación de genes cuyas funciones contribuyen a contender con medios hostiles. La activación de genes de defensa ante diferentes tipos de estrés inicia con la percepción de un estímulo particular que se transmite a través de una cascada de señalización de diferentes componentes que incluyen la movilización de iones, la generación de especies de reactivas oxígeno, la fosforilación de proteínas y la activación de factores de transcripción, cuya consecuencia final es la síntesis de proteínas que le permitirán a la planta vivir en un medio adverso. Las respuestas a diferentes tipos de estrés en las plantas transitan por vías comunes de señalización, donde las hormonas vegetales desempeñan un importante papel regulador que permite a la planta adaptarse rápidamente a su medio biótico e utilizar sus limitados recursos para el crecimiento y la supervivencia de manera eficiente. Así, el análisis del perfil de transcripción de genes inducidos por estrés biótico muestra un gran número de genes comunes inducidos por varios tipos de estrés abiótico, sugiriendo una compleja red regulatoria de interacciones en la respuesta de las plantas a distintas clases de estrés ambiental. Resultados en nuestro grupo de investigación indican que la aplicación de fosfito de potasio (KPhi) al tubérculo-semilla y al follaje de plantas de papa produce cambios fisiológicos, morfo-histológicos y/o subcelulares asociados a la resistencia a patógenos y al rendimiento del cultivo. Estudios bajo condiciones de crecimiento a campo revelaron que la aplicación de KPhi al tubérculo-semilla a la plantación y al follaje durante el cultivo de papa, produjeron: 1-adelanto en la emergencia de las plántulas, 2-incremento del área foliar verde e intercepción de radiación, 3-adelanto temporal de la cobertura foliar, 4-mayor contenido de clorofila, 5-mayor densidad promedio de tallos, 6-mayor diámetro del tallo aéreo, 7-aumento en la producción de materia seca total por planta y su distribución en estados tempranos de crecimiento, 8-reducción en la severidad de tizón tardío; 9-un adelanto en el inicio de la tuberización, y por ultimo a la cosecha del cultivo, 10- mayor rendimiento y calidad de la producción. Asi mismo, estudios anatomo-histológicos mostraron: 11-mayor acumulación de almidón en el parénquima del tallo aéreo lo cual mantuvo una directa relación con el contenido de azúcares totales, 12-mayor área porcentual de incrustaciones de lignina en el tejido vascular y fibras en tallos, 13-aumento en la materia seca y grosor de la peridermis de tuberculos, 14- menor tiempo de latencia en la brotación respecto a los controles, desarrollaron abundantes ramificaciones y raicillas desde los brotes, mostrando un adelanto temporal en los tiempos relacionados a las distintas edades fisiológicas del tubérculo. Ademas, bajo condiciones de crecimiento en cámara de cultivo, la aplicacion de CaPhi y KPhi, protegieron a los tubérculos-semilla, al follaje y a los tubérculos en post-cosecha contra Phytophthora infestans, Fusarium solani, Rhizoctonia solani y Erwinia carotovora. En lo que respecta a las respuestas de defensa inducidas por fosfitos en plantas tratadas con e infectadas con P. infestans se observó, en hojas: 15- rápida e intensa acumulación de especies reactivas de oxígeno (EROs -H2O2 y O2), 16-acumulación de calosa alrededor del sitio de infección, 17-inducción de fenilalanina amonio liasa (PAL) y en menor grado de enimas antimicrobianas, β-1,3-glucanasas y quitinasas; en tuberculos: 18-acumulación de fitoalexinas, 19-acumulación de quitinasas, 20- actividad de enzimas asociadas al sistema antioxidante, polifenol oxidasas (PPO) y guaiacol peroxidasas (POD).Por otro lado, en paredes celulares de tubérculos sanos o infectados con Fusarium solani, se detectó: 21-en cortex, aumento del contenido de pectina, un mayor contenido de inhibidores de serín proteasas (IP) y poligalacturonasas (PGIPs), y una disminución en la actividad de serin proteasa/s de F. solani (FESP), como factores de patogenicidad, 22-en peridermis, nuevas isoformas de quitinasas, 23-aumento en H2O2, nuevas isoformas de POD y de SOD, 24-mayor número de capas de felema y paredes celulares engrosadas, probablemente por la mayor acumulación de lignina, y un consecuente aumento en el grosor de la piel del tubérculo. Por otra parte, la inducción de los mecanismos de defensa de las plantas por los fosfitos no fue en detrimento del desarrollo y rendimiento del cultivo.Estudios fitopatológicos bajo condiciones in vitro mostraron actividad inhibitoria de los CaPhi, KPhi y CuPhi sobre el crecimiento de P. infestans, R. solani, F. solani y S. scabies, siendo CuPhi el fosfito más eficiente en dicha inhibición. P. infestans fue el patógeno más susceptible a la presencia de fosfitos en el medio, seguido por la bacteria S. scabies y por último los hongos R. solani y F. solani. Por otra parte, los fosfitos mostraron una actividad fungistática y no fungicida sobre esporas de F. solani. Resultados transcriptomicos indican que los fosfitos alteran la expresión de genes de las plantas de papa e inducen genes que participan en una respuesta de defensa, ofreciendo una mejor respuesta en la planta cuando se realiza el tratamiento en forma preventiva. La activación temprana de los genes que participan en la señalización y el aumento factores de transcripción en plantas tratadas, sustentan la idea que los fosfitos actúan vía priming activando la RI en plantas de papa. Proponemos que los primeros eventos provocados por el tratamiento fosfitos están relacionados con el refuerzo de pared celular, producción de compuestos con actividad antimicrobiana, cascada de señalización mediada por EROs y su modulación fina. Activan a priori a la infección genes relacionados con la señalización mediada por JA el MAPK4, la síntesis de etileno Acox y la percepción ETR2. También se observó una represión de genes relacionados con el metabolismo primario y energético, a tiempos cortos del tratamiento. Frente al patógeno P. infestans se indujo el factor de transcripción WRKY dependiente de SA, indicando una posible participación de SAR durante la respuesta inducida por fosfitos. Interesantemente el análisis del tratamiento sin infección y del tratamiento en presencia del patógeno, evidenció un solapamiento en un gran número de genes con diferentes funciones, destacándose los genes que participan en respuesta de defensa, genes de unión a ADN, regulación hormonal, estrés oxidativo, metabolismo secundario. La superposición en la inducción de estos genes indica que la Respuesta Inducida por los fosfitos puede basarse en la preactivación de genes de respuesta a defensa y su impulso luego del ataque del patógeno. Además, la activación temprana de genes que normalmente se activan durante la presencia de patógenos, junto con la disminución del metabolismo primario, entre ellos el aparato fotosintético, solo en condición de tratamiento con Phi, puede explicar la respuesta de defensa al amplio espectro de patógenos reportados por nuestro grupo.También se reveló un gran número de moléculas que codifican para la degradación de proteínas (proteinasas), como las serin proteasas que se encuentran tempranamente en una infección con P. infestans y F. solani. Por lo tanto, se podría especular que la expresión temprana de enzimas liberadas por el patógeno durante la infección, podrían ser contrarrestada por la presencia en la planta de estas proteinasas, lo que permitiría disminuir el avance de la infección una vez presente el patógeno en la hoja.La inducción de la Resistencia Inducida por fosfitos involucraría la activación de diversas vías de señalización, sugiriendo que, el tratamiento con fosfito induce las vías de JA y ET. Mientras que en las plantas tratadas y luego infectadas con P. infestans se induciría la activación de vías que involucran al SA.En conclusión, los resultados presentados confirman el modo de acción dual de los fosfitos en la protección a enfermedades en el cultivo de papa, y apoyan la utilización de estos compuestos dentro de un manejo integrado del cultivo debido su baja toxicidad y a la inducción de resistencia en papa contra un amplio rango de patógenos. La identificación de gran cantidad de genes de respuesta activados por el tratamiento con fosfitos, ayudo a comprender parte del mecanismo de acción de los mismos, y caracterizar un efecto de priming, especialmente los relacionados con la respuesta de defensa, el estrés oxidativo y la modulación de los mismos.