Validación de una metodología no invasiva para el estudio de la fisiología reproductora en machos de Chinchilla laniger.

BUSSO JM; PONZIO MF; LACUARA JL; CARRASCOSA R

Fac. Cs. Médicas, U.N.C.

Jornada; II Jornadas de Investigación Científica de la Fac. Cs. Médicas, U.N.C.; 2001

Fac. Cs. Médicas, U.N.C.

  La aplicación de métodos no invasivos para el estudio y monitoreo de la función reproductora de machos de Chinchilla laniger (amenazada de extinción en vida silvestre - CITES I-), constituíra una alternativa eficaz dado que los métodos convencionales (análisis de hormonas en sangre, estudio de semen electroeyaculado, etc) son agresivos y por lo tanto estresantes. En el presente estudio nos propusimos, en animales en cautiverio (que comparten características de especie con los ejemplares en vida silvestre): Determinar el tiempo de metabolización, la principal ruta de excreción de testosterona en orina y/o heces; evaluar los metabolitos de testosterona excretados; validar esta técnica para el estudio de la actividad endocrina en animales en cautiverio. Animales: Chinchillas (Chinchilla laniger) en cautiverio, sexualmente maduros y con fertilidad comprobada. Procesamiento de las muestras urinarias y fecales: La orina fue recogida con preservante (etanol 100%) y congelada hasta su análisis. Las heces fueron liofilizadas y los esteroides se extrajeron con etanol-agua al 90%. Infusión radioactiva: 14C-testosterona y enantato y propianato de testosterona sin marcar. Recolección de las muestras: durante 24 h antes de la administración (cada 8 h) y a partir de la administración de las hormonas exógenas, durante 96 h (cada 4h). Cromatografía liquida de alta presión (HPLC): Separación de metabolitos: Las muestras con mayor concentración de metabolitos radioactivos de la orina sin procesar y los extractos de heces fueron fraccionados mediante extracción con éter (1:10 agua-éter) en las fases polar y no polar. Purificación: Por extracción en fase sólida. Separación cromatográfica: Se utilizó un gradiente de metanol-agua 20-30-40-50-100 % por 0-10-40-55-120 min respectivamente. Radioinmunoensayo: Utilizando Coat-A-Count® (DPC), se demostró paralelismo y recuperación significativa de testosterona exógena agregada a muestras urinarias o fecales. Validación fisiológica: Se compararon los niveles de testosterona en orina en dos machos (antes y después de la inyección subcutánea de 2.5UI de hCG/g) y en hembras adultas. Análisis estadístico: Según lo adecuado, se aplicaron la prueba “t” de Student ó Wilcoxon (U Mann-Witney) a dos colas y se definió un valor p< 0.05 para significación estadística. Se detectó un pico de radioactividad a las 9h en orina y a las 24h en heces. El 78,5±13,4% de los metabolitos son excretados por orina y se presentan exclusivamente en forma conjugada, el resto, en heces, se conjuga hasta el 98%. La HPLC evidenció varios metabolitos en orina en la fase hidrosoluble, mientras que en heces, solo tres picos. La concentración de testosterona en orina en machos y en hembras fue significativamente diferentes (p<0,03). La validez de la cuantificación de metabolitos en testoterona se convalidó mediante la respuesta positiva a la inyección de hCG. CONCLUSIONES En base a los resultados expuestos surge claramente que la determinación de testosterona en excretas de Chinchilla laniger doméstica, es posible de ser efectuada mediante la aplicación del método no invasivo propuesto. Este ha sido previamente ensayado en otros mamíferos. Hemos verificado que: 1) Los metabolitos de testosterona son eliminados rápidamente en excretas (dentro de las 36 horas de la inyección del esteroide), detectándose el mayor porcentaje en orina. 2) Casi la totalidad de los mismos se presenta en forma conjugada tanto en orina como en materia fecal. 3) Los análisis cromatográficos en orina revelaron que existen picos no asociados a testosterona nativa y que serían metabolitos del esteroide (nuestros estudios actuales parecen indicar que androstenediona sería importante en esta especie). En materia fecal, se detectó un perfil de tres picos presentes, uno de los cuales se asoció con la hormona nativa. Finalmente, tanto las diferencias significativas entre machos y hembras como la respuesta a gonadotrofina coriónica y los valores de testosterona en orina de Chinchilla laniger machos, confirman la validez del ensayo.