Efecto del medio de reacción sobre la estabilidad de membranas de perlas de alginato utilizadas para la inmovilización enzimática.

E. QUIROGA; C. ILLANES; N.A. OCHOA

Salta

Congreso; VIII CONGRESO IBEROAMERICANO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE MEMBRANAS; 2012

Universidad Nacional de Salta

Los procesos catalizados por enzimas son frecuentemente considerados para su aplicación en la industria debido a sus numerosas ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos, dada su elevada estéreo y regioselectividad, condiciones moderadas de reacción, fácil manipulación y alta biodegradabilidad [1]. A pesar de estas ventajas, el uso de enzimas no se ha generalizado en los procesos químicos industriales ya que, al ser solubles en agua, se dificulta su separación de los sustratos y productos, impidiendo su reutilización. Además, las enzimas presentan estructuras lábiles e inestables frente a diversos factores físicos, químicos y biológicos, los cuales disminuyen su actividad catalítica y solubilidad en el tiempo [2]. La catálisis enzimática en fase heterogénea (enzimas inmovilizadas) ha permitido, por un lado, el uso más eficaz del catalizador al estabilizar la enzima y por otro, el desarrollo de procesos continuos con todas las ventajas operacionales asociadas, haciendo del proceso biotecnológico un proceso económicamente rentable. Una importante ventaja de la inmovilización de enzimas es la reutilización, incrementando así la productividad del proceso y disminuyendo el costo de operación [3]. Diferentes técnicas han sido desarrolladas para la inmovilización de enzimas. En particular, el método de inmovilización por entrampamiento es importante en aplicaciones farmaceúticas y en la industria de los alimentos. Tal metodología de inmovilización, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos y la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura. Sin embrago, el entrampamiento requiere un control riguroso de las condiciones de gelificación, así como la comprobación de que la naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína [4]. El entrampamiento de proteasas, tanto en perlas de alginato como en membranas poliméricas, ha permitido la obtención de derivados enzimáticos estables frente a diferentes condiciones de pH, temperatura y presencia de solventes orgánicos, haciéndolos catalizadores promisorios para su aplicación en la catálisis en medios orgánicos y en diferentes procesos industriales [4]. El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto de medios de reacción sobre la estabilidad de membranas de perlas de alginato utilizadas para la inmovilización de una proteasa cisteínica (araujiaina) de interés para la industria de los alimentos. El proceso de inmovilización se llevó a cabo variando la concentración de alginato de sodio (0,5-4%, v/v) y la cantidad de enzima entrampada (0,5-25mg) por mL de alginato. Para los ensayos mecánicos, las perlas de alginato de sodio se incubaron en buffer Tris-HCl (0,1M, pH 8,5) y en acetato de etilo (50% en buffer) a 37° C y con agitación orbital (160 rpm) por diferentes tiempos de incubación (0 a 170h). Para dichas medidas, se utilizó un equipo "Comten Industries" Serie 94 VC. La actividad hidrolítica fue medida en buffer Tris-HCl (0,1M, pH 8,5) utilizando BAPNA como sustrato, luego de 5 min de incubación a 37º C. La actividad sintética fue determinada en acetato de etilo (50% en buffer) siguiendo la formación del dipéptido Z-Ala-Phe.OMe, luego de 48h de incubación a 37º C. Bajo tales condiciones, el máximo rendimiento de inmovilización (definido como la relación de actividad enzimática antes y después de la inmovilización) fue de 91% con una relación de 15mg de araujiaína/mL de alginato al 2% (p/p). Al variar la cantidad de enzima entrampada se observó una directa relación del rendimiento de la inmovilización con la cantidad de enzima inmovilizada, hasta un valor de 15mg enzima/mL de alginato, correspondiendo al máximo valor obtenido. Así, se logró una alta eficiencia de entrampamiento: alrededor del 98% del contenido total de proteína fue inmovilizada no observándose una lixiviación de la misma durante el proceso catalítico. Luego de 170h de incubación, las membranas de las perlas de algino sólo perdieron un 30% de resistencia en acetato de etilo y un 25% en buffer, observándose una disminución en la resistencia de la membrana con el aumento en la polaridad del medio. Además, se evaluó la estabilidad operacional de la enzima inmovilizada (determinada como número de ciclos de reacción enzimática) en los medios estudiados. Al cabo de 20 ciclos de hidrólisis, araujiaína mantuvo el 78% de su actividad, en tanto que, mostró un 65% de su actividad al cabo de 8 ciclos de reacción de síntesis en acetato de etilo (50% en buffer). Tales ensayos muestran que alginato de sodio es un buen soporte para la enzima y que el mismo podría ser utilizado en procesos continuos sin que la enzima pierda eficiencia. Referencias: [1] F. Bordusa. Proteases in organic synthesis, Chem. Rev. 102 (2002) 4817-68. [2] A. Illanes. Stability of biocatalysts, Electron. J. Biotech. 2 (1999) 1-9. [3] A. Illanes. Enzyme biocatalysis: principles and applications, Springer Science (2008). [4] R.A. Sheldon. Enzyme immobilisation: The quest for optimum performance, Adv. Synth. Catal. 349 (2007) 1289-307.