MÉTODO ELECTROQUÍMICO PARA DETERMINAR LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE SELENIO COMPARADO CON ANTIOXIDANTES NATURALES Y ARTIFICIALES FRENTE AL RADICAL SUPERÓXIDO

FRANCO A. BERTOLINO,; NOELIA A. MARTÍNEZ,; GERMÁN A. MESSINA,; ELOY SALINAS,; JULIO RABA

San Miguel de Tucumán

Congreso; XXVII Congreso Argentino de Química Dr. Pedro José Aymonino; 2008

Asociación Química Argentina

MÉTODO ELECTROQUÍMICO PARA DETERMINAR LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE SELENIO COMPARADO CON ANTIOXIDANTES NATURALES Y ARTIFICIALES FRENTE AL RADICAL SUPERÓXIDO     Franco A. Bertolino, Noelia A. Martínez, Germán A. Messina, Eloy Salinas, Julio Raba   INQUISAL. Departamento de Química, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, UNSL, Chacabuco y Pedernera 5700, San Luis, Argentina. E-mail: bertolin@unsl.edu.ar     Introducción Ha sido bien estudiado que el anión superóxido (O2•) y sus productos subsiguientes como el agua oxigenada y el radical hidroxilo (OH•) son potentes especies reactivas  del oxígeno (EROS), lo cual podría causar efectos dañinos a los sistemas biológicos1. La intoxicación del O2• en los sistemas biológicos es un criterio importante de como las EROS le podrían causar daño a los componentes de la célula. Con excepción de la enzima superóxido dismutasa, los sustractores eficientes del O2• en organismos vivos son los antioxidantes, los cuales juegan un papel vital en la desintoxicación de las EROS. Con respecto a esto, los compuestos fenólicos son atractores suprimiendo la formación in vivo del O2•, OH• y NO. Alternativamente, podrían resultar de fuentes exógenas como la exposición a contaminantes, radiación ionizada y otros factores extremos2. El estrés oxidativo es a menudo asociado con la conducción o generación de las EROS. Hay diferentes mecanismos de acción de los antioxidantes. El más importante para nuestro estudio es el que disminuye el nivel de productos activos debidos a la reducción del oxígeno. Esto conduce a la inhibición de las reacciones de los radicales libres3. Dos clases de antioxidantes son conocidos: los compuestos de bajo peso molecular (BPM) como α-tocoferoles, ascorbato, ácido gálico, etc. y los de alto peso molecular (APM) como las proteínas: albúmina, transferrina, superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa, etc4. Los compuestos de selenio protegen las membranas de la célula del daño oxidativo; catalizan las reacciones del metabolismo intermedio e inhiben la toxicidad de algunos metales pesados (como, Cd, Pb, Tl, Hg y Sn)5. Los métodos electroquímicos son desarrollados para: a) la investigación de propiedades antioxidantes en fluidos biológicos en particular en sangre, b) la estimación de su capacidad antioxidante total y c) aclarar el papel en el sistema de defensa antioxidante6. La voltametría cíclica (VC) ha sido validada para la cuantificación de la capacidad antioxidante de los antioxidantes de BPM en sangre, plasma, homogenatos de tejidos7 y para la medida de la capacidad antioxidante total en plasma de pacientes con enfermedad renal crónica durante la terapia de diálisis8. El objetivo de este estudio es investigar la eficacia anti-radical o la capacidad antioxidante de selenio (Se) en medio orgánico de acetonitrilo (ACN) en presencia de tetrabutilaminohexafluorofosfato (TBAHFF), como electrolito soporte y compararla con la eficacia anti-radical de compuestos conocidos como α-tocoferol (α-T), ácido gálico (AG), ácido caféico (AC), ter-butilhidroquinona (TBHQ) y trolox (Trx).   Metodología Se efectuó un estudio electroquímico de la capacidad antioxidante de Se, a-T, AG, AC, TBHQ y Trx utilizando una técnica amperométrica como lo es la VC, partiendo de la cupla reversible (O2/O2•) en medio aprótico de ACN, en una atmósfera saturada de O2 (99.98 %) para lo cual se burbujeó oxígeno directamente dentro de la celda durante 10 minutos. Durante las medidas se mantuvo un corriente de oxígeno sobre la solución de la celda. Los experimentos electroquímicos se realizaron utilizando una estación de trabajo BAS 100/W (Bioanalytical System, West Lafayette IN). Para las VCs se empleó un sistema de tres electrodos: el de trabajo fue de Carbono Vítreo, el contra electrodo un alambre de platino y como electrodo de referencia se utilizó Ag/AgCl/3MNaCl. Las medidas de corriente se realizaron por inmersión de los tres electrodos en 10 ml de ACN que contiene 0,1 M de TBAHFF como electrolito soporte. Se evaluó el comportamiento electroquímico de la cupla reversible O2/O2• frente a las adiciones de cantidades crecientes y conocidas de selenio y además de los diferentes antioxidantes.   Resultados Se realizaron voltamogramas cíclicos típicos de la cupla O2/O2•, con concentraciones conocidas y crecientes de Se, a-T, AG, AC, TBHQ y Trx. Se evaluó la capacidad de sustracción del O2• que presentan los distintos compuestos. El barrido de potencial fue de 0 a -1.5 V en sentido catódico a una velocidad de barrido de 50 mVseg-1. Se encontraron dos picos (a y b); el pico de reducción a corresponde a la formación del O2• a partir del O2 disuelto en la solución y el pico de oxidación b que corresponde a la regeneración de O2 a partir del O2• formado sobre la superficie del electrodo. El pico de oxidación b disminuye con las adiciones de concentraciones crecientes de Se y de los diferentes antioxidantes. La Figura 1 muestra los voltamogramas cíclicos para las diferentes concentraciones de Se, el blanco y el 99,98 % de O2, obteniéndose resultados similares para los demás compuestos. Figura 2. Porcentaje de inhibición de la corriente generada por el O2• luego de adiciones sucesivas de antioxidantes.     Figura 1. Voltamogramas cíclicos de la cupla O2/O2. para las diferentes concentraciones de Se. 50 mVseg-1. La gráfica insertada posee un I= 33,6238 - 1,9739 x C, R= -0,9976     La capacidad bloqueante de los diferentes compuestos estudiados se comparó normalizando los resultados obtenidos de corriente (µA), de esta manera en la Figura 2 podemos observar el porcentaje de corriente de inhibición de la formación  del O2• (I %), logrado a distintas concentraciones (µM) para cada uno de los compuestos estudiados. La investigación sobre el bloqueo o eliminación del O2• es útil para comprender la protección de los sistemas biológicos frente a las EROS. En este trabajo se demostró la capacidad del método electroquímico propuesto para evaluar la actividad antioxidante de los compuestos estudiados. La actividad antioxidante se evaluó de acuerdo a los siguientes parámetros: CI50 (que expresa la concentración de antioxidante necesaria para disminuir la intensidad de corriente en un 50%), TCI50 (expresa el tiempo necesario para alcanzar el estado estable a la concentración del CI50) y ambos factores pueden ser combinados en el parámetro de la eficacia antioxidante, EA = 1 / CI50 × TCI50), con el fin de caracterizar fácilmente el comportamiento de una sustancia como antioxidante.   Tabla 1 Antioxidantes IC50 (x10-6 M) TIC50 min AE50 (x10-3) Se 7.29 + 0.3 57.7 + 0.7 2.4 + 0.1 GA 4.76 + 0.2 49.1 + 0.8 4.3 + 0.2 CA 5.87 + 0.3 36.1 + 0.6 4.7 + 0.2 TBHQ 0.78 + 0.1 32.5 + 1.0 39.3 + 2.0 α-T 0.46 + 0.1 22.3 + 0.9 98.1 + 2.2 Trx 0.50 + 0.2 21.4 + 0.8 93.9 + 2.1   En la Tabla 1 se muestran los diferentes valores de los parámetros de eliminación del O2• de los compuestos estudiados: CI50, TCI50 y EA. Donde podemos observar que la CI50 más alta es la de selenio (7.29 µM + 0.3) al igual que su TCI50 (57.7 min + 0.7) y su EA (2.4 + 0.1), en contraste a estos valores la CI50 más baja es la de α-tocoferol (0.46 µM + 0.1) siendo su TCI50 (22.3 min + 0.9) y su EA (98.1 + 2.2). Dentro de los derivados fenólicos el que tuvo un mejor comportamiento antioxidante fue TBHQ con un CI50 (0.78 µM + 0.1), un TCI50 (32.5 min + 1.0) y su EA (39.3 + 2.0). Todas las medidas se realizaron por triplicado.   Conclusiones De acuerdo a nuestros estudios podemos inferir que α-tocoferol es un excelente sustractor del O2• superando por muy poca diferencia a su derivado trolox. Estos valores tan cercanos es debido a que su estructura química es muy similar por lo tanto tienen el mismo mecanismo de acción y a su vez barren aproximadamente la misma cantidad del radical. Dentro de los derivados fenólicos el mejor comportamiento antioxidante se evidencia en TBHQ debido a que puede liberar con mayor facilidad sus protones por tener un fuerte grupo donor en su molécula. Por último selenio parece utilizar otro mecanismo de acción diferente a los demás compuestos, produciendo un muy buen efecto a muy bajas concentraciones y luego en forma progresiva a lo largo de las concentraciones.   Referencias E.D. Hall, J.M. Braughler, Free Radic. Biol. Med. 6 (1989) 303. B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, Clarendon Press, Oxford, 1989, 86–179. M. Chevion, Free Radical Biol. Med. 5 (1988) 27. C. Rice-Evance, N.J. Miller, Meth. Enzymol. 234 (1994) 279. L. Campanella, T. Ferri, R.A. Morabito, Analusis 17 (1989) 507. M.E. Johll, D.C. Johnson, Electroanalysis 11 (1999) 534. S. Chevion, V.A. Roberts, M. Chevion, Free Radical Biol. Med. 28 (2000) 860. J. Potova, J. Zahalkova, J. Bartek, Biomed. Palacky Czech. Repub. 145 (2001) 81