Proteasa extracelular de Natronococcus occultus. ¿Una nueva enzima?

R.E.DE CASTRO, C.A.STUDDERT, K. HERRERA SEITZ Y J.J. SÁNCHEZ.

Mendoza

Congreso; Reunion Anual de SAIB; 1998

N.occultus es una arquea haloalcalófila que habita en ambiente de extrema salinidad y pH (~ 3 M NaCl y pH ~ 10). Hemos descripto la presencia de actividad proteolítica extracelular y asociada a las células en N.occultus, y posteriormente hemos reportado la purificación y caracterización de una serín proteasa extracelular en este microorganismo. En el presente trabajo se demuestra que la heterogeneidad de especies activas observadas en zimografías se debe a autólisis parcial de la enzima, principalmente cuando se reemplaza la sal por betaína 4 M. Cuando la proteasa purificada es inhibida por PMSF, y posteriormente analizada por SDS-PAGE (con betaína 4M) se observa una banda de proteína principal de ~ 90 kDa, una minoritaria de 120 kDa y varias especies de menor Mr. Se levantaron anticuerpos contra la proteína de 90 kDa y se realizaron ensayos de westernblot con muestras de la proteasa incubadas con o sin PMSF. El anticuerpo reconoció todas las especies proteicas, mostrando que todas ellas estarían relacionadas. En ensayos de westernblot realizados con extractos celulares y anticuerpos contra la proteasa extracelular se detectó una especie inmunoreactiva de ~ 90 kDa, indicando que al menos parte de la actividad asociada a las células estaría relacionada con la extracelular. Con el propósito de comparar la proteasa extracelular de N.occultus con otras enzimas conocidas se secuenció el extremo N-terminal de las especies de 120 y de 90 kDa y de tres péptidos trípticos derivados de la proteína de 90 kDa. Las secuencias N-terminal de las especies de 120 y de 90 kDa resultaron ser muy similares , sugiriendo que la especie de mayor tamaño podría representar una forma más compleja de esta enzima. Cuando estas secuencias fueron comparadas con las de otras proteínas en una base de datos no se encontraron similitudes significativas. Este reultado, sumado a la mayor Mr nativa (~130 kDa) en comparación con la de otras proteasas extracelulares halofílicas sugiere que la proteasa extracelular de N.occultus podría ser una nueva enzima proteolítica