Utilización de librería Christ para producción de VH anti-tubulina humano

DAMIANI MT; AVILA MANIERO M; MOUTEL S; SYBILLIN C; PEREZ F

Congreso; IV Reunión Conjunta de soc. de biología; 2020

SBCUYO

La tecnología de phage display es una herramienta altamente poderosa, que inicialmente fue utilizada para la selección de péptidos, luego fue aplicada a generar fragmentos de anticuerpos frente a cualquier antígeno como son scFv, VH o VHH. Esta tecnología permite generarla fusión de los anticuerpos a las proteínas de la cápside de bacteriófagos, donde finalmente va a ser inducida su expresión para la selección. Como sistema de expresión se utiliza E. Coli que posee una gran velocidad de crecimiento y para lo cual no es necesario contar con complejas herramientas de laboratorio. Una de las grandes ventajas de esta tecnología phage display, es evitarse la utilización de animales para la producción de anticuerpos. Actualmente, muchos de ellos se encuentran en el mercado para ser usados como tratamiento para diversas patologías. La librería Christ utilizada en este trabajo produce anticuerpos con dominio humano, y fue generadapor el laboratorio Christ del Instituto Garvan, Australia. Con el objetivo de comenzar a utilizar esta librería se realizó la selección de anticuerpos contra el antígeno Tubulina. Para ello se adsorbió Tubulina biotinilada sobre beads magnéticas recubiertas con estreptavidina. Para corroborar la correcta adsorción del antígeno a las beads se realizó la detección por western blott de una alícuota de las mismas una vez finalizada la sensibilización. La selección se llevó a cabo con una primera ronda de depleción para poder eliminar los anticuerpos inespecíficos que se uniesen a las beads sin proteína adsorbida. Posterior a ello se realizaron dos rondas de selecciónutilizando 1.4 µg de Tubulina por ronda. Al finalizar, fueron testeados 40 clones que fueron inducidos con IPTG para lo cual se utilizaron líneas celulares HeLa WT cultivadas sobre cubres redondos y fijadas con metanol por 4 minutos. Para la detección de los VH expresados en cada clon, se utilizó el anticuerpo rabbit anti Myc, y posteriormente anti rabbit - Cy3. De los clones testeados, seis fueron positivos ya que en comparación con un anticuerpo específico contra Tubulina se puede comparar la misma marcación. Cabe destacar que la metodología utilizada fue desarrollada, testeada y publicada previamente por el laboratorio de anticuerpos recombinantes del instituto Curie en París. El uso de metodología previamente validada nos permitió comprobar la capacidad de la librería Christ para ser utilizada en la producción del anticuerpo anti-Tubulina, elemental para el trabajo diario de un laboratorio.