CARACTERIZACIÓN DE LA GLICOSILACIÓN DE LA PROTEÍNA DE CAPA S EN LACTOBACILLUS KEFIRI CIDCA 8321

CAVALLERO G; CASABUONO A; MALAMUD M; SERRADELL MA; COUTO AS

Rosario (Santa Fe)

Congreso; III Congreso Argentino de Espectrometría de Masas (CAEM); 2016

Sociedad Argentina de Espectrometría de Masas (SAEM)

Las proteínas denominadas capa S (S-layers) son ubicuas en bacterias y Archaeas. Si bien es conocido que la glicosilación es la modificación postraduccional más frecuente en estas proteínas y recientemente se han reportado proteínas de capa S glicosiladas en diversas especies del género Lactobacillus, en solo una de ellas, L. buchneri, la modificación ha sido estudiada estructuralmente. En el presente trabajo utilizando como herramientas UV-MALDI-TOF y nanoHPLC-ESI-Orbitrap, se caracterizó la O-glicosilación de la proteína de capa S de la cepa Lactobacillus kefiri CIDCA 8321. El estudio de la proteína de capa S en la cepa 8321 se dividió en dos niveles: caracterización del glicano que compone la glicoproteína, y determinación del sitio de glicosilación. Para el primer objetivo, un extracto de proteínas de superficie fue analizado por SDS-PAGE y la banda correspondiente a la proteína capa S fue cortada y sometida a una -eliminación reductiva (0.05M NaOH, 1M NaBH4, 50°C, 16h). Una fracción de los oligosacáridos liberados, fue hidrolizada y los azúcares componentes fueron analizados por HPAEC-PAD determinándose glucosa como componente neutro mayoritario y ácido galacturónico como componente acídico. Otra fracción fue analizada por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF. Los resultados obtenidos mostraron la presencia de oligosacáridos conteniendo unidades repetitivas de HexA-Hex que fueron confirmados por experimentos MS/MS. Por otra parte, con el fin de determinar el sitio de O-glicosilación, la banda correspondiente a la proteína capa S proveniente de SDS-PAGE fue sometida a una digestión enzimática con tripsina seguida de Glu-C. Por medio de la técnica Cotton HILIC, una fracción fue enriquecida en glicopéptidos y fue analizada por nanoHPLC-ESI-ORBITRAP. Los espectros obtenidos mostraron la presencia de un único péptido conteniendo el motivo SASASSASSASSA sustituido por hasta 28 unidades de monosacáridos. La estructura del oligosacárido determinada difiere significativamente de la descripta para L. buchneri, a pesar de que el motivo peptídico es el mismo, indicando que incluso en microorganismos estrechamente relacionados filogenéticamente, la glicosilación puede ser muy diversa.