Purificación de toxina A de Clostridium difficile y obtención de anticuerpos monoclonales

TREJO, FM.; SERRADELL, M.; RUSCONI, ME.; GUZZETTI, L.; PÉREZ, PF.

Rosario, Argentina

Jornada; XIII Jornadas Argentinas de Microbiología; 2008

Asociación Argentina de Microbiología

Clostridium difficile es un bacilo Gram (+) formador de esporos cuyos principales factores de virulencia son dos toxinas, A (TcdA) y B (TcdB). En pacientes hospitalizados el tratamiento con antineoplásicos, fluoroquinolonas o antibióticos (clindamicina, cefalosporinas, etc.) otorga condiciones favorables para la colonización por Clostridium difficile, siendo este patógeno responsable del 90-100 % de los casos de colitis pseudomembranosa, 60-75% de colitis asociada a antibióticos y del 30-60 % de las diarreas asociadas a antibióticos. Los métodos más empleados para el diagnostico de infecciones por C. difficile son enzimoinmunoensayos (EIA) que detectan producto (TcdA/TcdB) y métodos moleculares basados en PCR que detectan los genes que codifican para dichas toxinas. En nuestro país  se cuenta con kits de tipo EIA los cuales son importados y de elevado costo. Los objetivos de este trabajo fueron purificar la TcdA y obtener anticuerpos monoclonales (AcMo) específicos. Para la purificación de la toxina se partió de 200ml de un cultivo de la cepa de C. difficile VPI 10463 crecida en BHI dentro de bolsa de diálisis (cut-off 6000-8000 kDa), los mismos se lavaron con bufferTris pH 7,5 por ultrafiltración empleando membrana de 100kDa. La purificación se continúo por FPLC empleando como relleno de intercambio DEAE Sepharose Fast-Flow. Las fracciones conteniendo la toxina A juntaron y concentraron obteniéndose la toxina purificada por precipitación a pH 5. Los AcMo fueron obtenidos empleando la técnica de hibridación de células somáticas de Galfré y Milstein. Brevemente, ratones BALB/c fueron inmunizados con 3 inoculaciones por vía intraperitoneal con TcdA parcialmente purificada, en adyuvante de Freud. Al término del plan de inmunización, el animal con mayor titulo de anticuerpos en suero fue sacrificado y sus células de bazo fueron fusionadas con la línea celular de mieloma murino (NSO). De dicha fusión se obtuvieron tres hibridomas productores de AcMo específicos capaces de reconocer la TcdA. Sobre muestras filtradas de pacientes hospitalizados son sintomatología de diarreas asociada a C. difficile, en particular el AcMo 4E10 mostró el mismo patrón de reactividad por dot blot en relación a un anti-TcdA comercial.