Desarrollo de una estrategia de colaboración para contribuir al diagnóstico de diarreas asociadas a Clostridium difficile

TREJO, FM; RUSCONI, ME; GUZZETTI, L; SERRADELL, M; HUMEN, MA; ZAMBONI, MI; GUARDATI, MC; LEJONA, S; ROLLET, R; PÉREZ, PF

Córdoba, Argentina

Congreso; XI Congreso Argentino de Microbiología – Asociación Argentina de Microbiología; 2007

Asociación Argentina de Microbiología

Clostridium difficile, es responsable de diarreas en pacientes tratados con antibióticoso antineoplásicos. Produce las toxinas TcdA (enterotoxina) y TcdB (citotoxina). Losmétodos diagnósticos van de la detección de toxinas empleando costosos kits comerciales,a ensayos de PCR. El objetivo fue implementar una estrategia de colaboración entre distintos grupos para contribuir al diagnóstico de diarreas asociadasa C. difficile. El trabajo tuvo 3 ejes: ensayos biológicos, PCR (tdcB) y ensayosinmunológicos. Como método de referencia para la detección de TcdB se ensayó lacitotoxicidad sobre células Vero. Se analizaron muestras de heces de pacientescon antecedentes de tratamiento antibiótico y sospecha de colitis pseudomembranosay muestras de hamsters infectados con C. difficile toxigénico. De cadamuestra humana, una parte se usó para la PCR y el resto se diluyó en buffer y sefiltró (0.45 um). Sobre diluciones seriadas de los sobrenadantes (SN) se ensayó laactividad citotóxica y la presencia de TcdA y TcdB (dot blot con anticuerposmonoclonales comerciales). Las muestras de animales fueron sometidas al ensayobiológico y dot blot. La purificación de toxinas se hizo con la cepa ATCC 9689crecida en BHI. El sobrenadante de cultivo se concentró con membrana de 10kDAy se sembró en una columna de intercambio aniónico. La producción de toxinas deesta cepa se comparó con aislamientos clínicos. Los resultados de muestras dehamsters en el ensayo biológico mostraron la capacidad de distinguir positivos denegativos sin neutralizar toxinas con anticuerpos. En muestras de origen humano,la presencia de TcdB (dot blot) en los filtrados fecales correlacionó con marcadoefecto citopático sobre células Vero (título>4000). Muestras negativas presentaronefecto nulo o bajos títulos (<16). Se observaron divergencias entre resultados dePCR para TcdB y efecto biológico que pueden explicarse por deleción de secuenciasen el genoma. En la purificación de toxinas lograron separarse diferentes fraccionesy algunas son reactivas sólo con el anticuerpo para TcdA. Se observandiferentes títulos de toxinas (dot blot y citotoxicidad) en cepas de diferentes orígenes.CONCLUSION: Las condiciones de los ensayos de citotoxicidad, PCR y dotblot resultan adecuadas para desarrollar estrategias de diagnóstico de C. difficileen nuestro país. El análisis de un mayor número de muestras permitirá la validaciónde métodos alternativos como la PCR y el dot blot en referencia al estándar aceptadopara TcdB que es el ensayo de citotoxicidad. Los avances en la purificación deTcdA permitirán generar anticuerpos para implementar métodos inmunológicos alternativospara el diagnóstico.