Separación mediante FPLC de Isoenzimas de Polifenoloxidasas presentes en frutilla

SERRADELL, M.A.; ROZENFELD, P.A.; MARTINEZ, G.A.; CIVELLO, P.A.; CHAVES, A.R.; AÑÓN, M.C.

Buenos Aires, Argentina

Congreso; X Seminario Latinoamericano y del Caribe de Ciencia y Tecnología de Alimentos; 1997

AATA

Las polifenoloxidasas (PPO) son enzimas ampliamente distribuidas en tejidos vegetales, y catalizan la oxidación de mono y difenoles a quinonas. Dentro de la célula, en la mayoría de los casos, PPO se encuentra compartamentalizada y separada de sus posibles sustratos. Sin embargo, la manipulación necesaria para la cosecha y el almacenamiento de frutos de interés comercial puede dañar las estructuras subcelulares y poner en contacto a esta enzima con sus sustratos. De este modo, PPO oxida los fenoles y provoca el denominado pardeamiento enzimático que puede afectar la calidad comercial y nutricional de los productos. Las quinonas generadas por la acción de PPO también pueden reaccionar con las proteínas presentes modificándolas y, en el caso de enzimas, provocar su inactivación. Asimismo, se ha sugerido que PPO podría inducir la decoloración de antocianinas, pigmento hidrosoluble responsable del color de numerosos frutos, incluyendo las frutillas. Este efecto indeseable puede provocar una pérdida del color característico del fruto o su jugo con la consecuente pérdida de calidad. El objetivo del presente trabajo fue separar mediante FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) las isoenzimas con actividad de PPO en frutillas de la variedad Selva. El extracto enzimático se preparó a partir de polvo de acetona de frutos en el estadío “verde”, dado que es el que presenta mayor actividad específica. La enzima se extrajo a pH 6,0 en buffer fosfato de sodio 100 mM adicionado con Tritón X-100 0,1%, NaCl 1M y PVPP (polivinil-polipirrolidona). A partir del extracto crudo anterior se obtuvo la fracción precipitable con 45-90% de saturación con (NH4)2SO4, se redisolvió el sólido obtenido en buffer fosfato de sodio 100 mM, pH 6,0 y se dializó primero contra agua bidestilada y luego contra buffer A (ácido acético-acetato de sodio 20 mM, pH 5,2). El extracto se concentró mediante ultrafiltración y se analizó mediante cromatografía de exclusión molecular en FPLC (columna XK 16/40, rellena con Sephacryl S-300; flujo 0,5 ml/min de buffer A). Se midió la actividad de PPO frente a pirocatecol y el pool de fracciones con actividad enzimática se concentró mediante ultrafiltración. El concentrado se analizó mediante cromatografía de intercambio iónico en FPLC (columna XK 16/40, rellena con SP-Sepharose; flujo 1ml/min). Para la elusión se utilizó un gradiente de buffers A y B (buffer A + NaCl 1,3M). El esquema descripto permitió separar las ods isoenzimas con actividad PPO presentes en frutillas (pI 7,1 y 8,2).