Nuovi Nitroni Amidinochinossalinici come Antiossidanti

NADIA GRUBER; LILIANA R. ORELLI; ROBERTO CIPOLLETTI; PIERLUIGI STIPA; SIMONA SABBATINI; VERNON TEBONG MBAH; GIOVANNA MOBBILI; CRISTINA MINNELLI

Udine

Congreso; X Convegno Nazionale AICIng; 2016

Associazione Italiana di Chimica per Ingegneria

Introduzione: L accoppiamento della tecnica dello Spin Trapping alla spettroscopia EPR (Electron Paramagnetic Resonance) rappresenta una delle metodiche più efficienti per rilevare ed identificare radicali liberi organici caratterizzati da un tempo di vita troppo breve rispetto alla scala dei tempi delle spettroscopie convenzionali. [1] Essa si basa sull impiego di specifiche molecole non paramagnetiche (Spin Traps) capaci di addizionarsi molto velocemente a specie radicaliche transienti, eventualmente formatesi nel corso di una reazione, per formare specie paramagnetiche (Spin Adducts) caratterizzate da un tempo di vita sufficientemente lungo da poter essere studiate all?EPR: l?analisi approfondita del segnale così registrato permette non solo di dimostrare la formazione di queste specie radicaliche transienti, ma anche la loro identificazione e caratterizzazione. Una categoria di Spin Traps largamente utilizzata in questa tecnica è rappresentata dai Nitroni (N-Ossidi), perché reagiscono molto velocemente con i radicali liberi organici, sia centrati al Carbonio che su Eteroatomo, per formare Nitrossidi Radicali, i radicali liberi organici più persistenti in soluzione liquida finora conosciuti. [2] Per questo motivo tale classe di composti è particolarmente utilizzata, ma anche continuamente studiata con l?obiettivo di risolvere alcune problematiche che ne limita l impiego nei sistemi biologici. In questa ottica abbiamo studiato in precedenza una serie di Nitroni a struttura Amidinochinossalinica, [3],[5] concludendo che la loro attitudine ad agire come Spin traps, diversamente da quanto verificato nei loro analoghi di tipo benzossazinico, [4] è fortemente condizionata dall?ingombro sterico presente al Carbonio in posizione  al raggruppamento N-O.Questo studio ha però anche evidenziato che un aumento dell?ingombro sterico, se da un lato rappresenta un limite perché produce una diminuzione della velocità di addizione di radicali peggiorando le loro caratteristiche di scavengers, aumenta però notevolmente la stabilità degli addotti risultanti dall intrappolamento di radicali all Ossigeno (ROS), aumentandone notevolmente il tempo di vita, costituendo così invece un punto di forza. Opportuni calcoli di tipo DFT hanno mostrato che l?insolita persistenza registrata degli addotti con radicali OOH è molto probabilmente dovuta alla formazione di ponti Idrogeno intramolecolari. Sulla base di questi risultati abbiamo condotto uno studio preliminare riguardo un eventuale impiego di questi derivati come antiossidanti in sistemi biologici. Materiali e metodi. I nitroni studiati sono stati sintetizzati come descritto precedentemente. [3] La L--fosfatidilcolina (PC), 2,2´-azobis(2-amidinopropano) dicloridrato (AAPH), Butil-idrossitoluene (BHT), acido tiobarbiturico (TBA), e tutti gli altri reagenti e solventi sono stati utilizzati senza ulteriore purificazione.Le misure spettrofotometriche sono state effettuate per mezzo di un lettore di piastre Biotek Sinergy HT. I Liposomi sono stati preparati secondo il thin film hydration method. [6] Quantitativi appropriati delle soluzioni in cloroformio di L--fosfatidilcolina e dei nitroni da studiare sono stati mescolati in rapporto molare 50:1. Il solvente è stato evaporato con un flusso di azoto ed il film lipidico ottenuto è stato poi seccato per 2 ore a pressione ridotta e risospeso con una soluzione di PBS. Dopo incubazione per tutta la notte, i liposomi multilamellari ottenuti (MLV) sono stati sonicati. Per le ossidazioni, campioni appositi sono stati addizionati con AAPH e incubando per 2 h a 310K. Successivamente la reazione è stata interrotta con l?aggiunta di BHT, e sono stati aggiunti i reattivi per effettuare la determinazione spettrofotometrica dei derivati carbonilici secondo il saggio dell Acido Tiobarbiturico (TBARS). [7] L attività antiossidante è stata determinata come percentuale di inibizione, calcolata in base alle differenze di assorbimento a 539 nm tra campioni additivati e non di antiossidante.Risultati e discussioneI risultati ottenuti indicano chiaramente che i nitroni studiati sono caratterizzati da un?apprezzabile potere antiossidante. Per una valutazione comparativa, è stato incluso nella serie un nitrone commerciale, l?N-tert-butil--fenil-nitrone (PBN), già studiato come antiossidante: i derivati da noi sintetizzati si sono dimostrati decisamente più efficaci, come mostrato nella figura sottostante. Ulteriori studi sono tuttora in corso con lo scopo di individuare un possibile meccanismo alla base di questa caratteristica.Bibliografia[1] E. G. Janzen, B. J. Blackburn, J. Am. Chem. Soc., 90, 5909, (1968)[2] E. G. Janzen, Acc. Chem. Res., 4, 31, (1971)[3] N. Gruber, L. L. Piehl, E. Rubin de Celis, J. E. Díaz, M. B. García, P. Stipa, L. R. Orelli, RSC Advances, 5, 2724, (2015)[4] P. Stipa, P. Astolfi, M. Marini, J. Org. Chem., 72, 8677, (2007)[5] N. Gruber, PhD Thesis, Universidad de Buenos Aires, Argentina, (2016)[6] P. Astolfi, P. Carloni, M. G. Marini, G. Mobbili, M. Pisani, P. Stipa, RSC Adv., 3, 22023?22030, (2013)[7] J. A. Buege, S. D. Aust, Methods Enzymol., 52, 302, (1978)