Construcción de vectores adenovirales

HEREÑÚ CB,; RIMOLDI OJ,; GOYA RG.

Neurogénesis

BARSA SRL

Lugar: La Plata, Buenos Aires Argentina; Año: 1999; p. 365 - 382

Se trata en detalle en este capítulo la metodología empleada para la construcción de vectores adenovirales recombinantes derivados de adenovirus tipo V. Con estos fines se trabaja con una serie de plásmidos los cuales contienen la información para construir un vector viral derivado del Adenovirus tipo V (Ad5). Los plásmidos utilizados son: pBluescript KS que contiene el cDNA de interés, en este caso, el que codif ica para el factor de crecimiento insulino-smil 1 (IGF-I). Este cDNA puede ser escindido por doble digestión con las enzimas de restricción XhoI y EcoRI.El plásmido pCA14 que se usa para un pasaje intermedio del inserto. El pDC515, provisto del promotor del gen inmediato temprano del citomegalovirus murino (mCMV), de un polylinker (sitio de policlonado) en el que cortes con Sal I y Bam H I permiten clonar el inserto de IGF-1, formando así el plásmido de transferencia (shuttle) con el que se trabaja posteriormente en células. Detrás del polylinker se ubica una señal de poliadenilación del virus SV40,que permitirá que el ARNm del inserto pueda ser traducido en la célula huésped. Este plásmido posee también un elemento Frt que permite el reconocimiento por la FLP recombinasa a fin de producir la recombinación sitio-dirigida con el plásmido genómico. También poseen un sitio de origen de replicación y un gen resistencia a la ampicilina, para poder expandirlos en bacterias. El plásmido genómico pBHGfrt(del)E1,3FLP, que contiene el genoma del Ad5 salvo deleciones en la región E1 y E3. Este plásmido posee además el gen de la FLP recombinasa (de levadura) bajo el control del promotor del CMV humano con una señal de poliadenilación del SV40, ubicada "downstream" del gen. Contiguo al gen pIX hay un elemento Frt, que permitirá la recombinación sitio-dirigida con el shuttle. Los sitios de recombinación específicos catalizados por la recombinasa FLP, dan alta eficiencia para recombinar el cassette de expresión en la región E1. La deleción en la región E3 contiene un único sitio de clonado Pac I, donde es posible insertar un gen reporter o una secuencia reguladora. El pFG140 contiene el genoma del Ad5 como virus salvaje que puede usarse de control positivo de transfección.