Procesamiento para microscopía electrónica de barrido de parásitos de interés sanitario sin la utilización de punto crítico

MÓNICA OPPEDISANO, MARINA MAGGIORE, PATRICIA PENSEL, JULIA FABBRI, MARÍA CELINA ELISSONDO

Mendoza

Congreso; 3er Congreso Argentino de Microscopía; 2014

Asociación Argentina de Microscopía - SAMIC -

Introducción La hidatidosis es una zoonosis parasitaria causada por el estadio larval del cestode Echinococcus granulosus. La quimioterapia con albendazole es la única opción, con una efectividad menor al 50%. Como consecuencia, la búsqueda de nuevos fármacos con posible actividad sobre E. granulosus es importante para evaluar nuevas formas de tratamiento. La búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas se realiza a dos niveles: in vitro sobre protoescólices y quistes, e in vivo utilizando el modelo experimental murino. En los estudios in vivo, los ensayos de fármacos se realizan para evaluar el efecto quimioterapéutico simulando lo que puede ocurrir cuando se produce una ruptura quística y la consecuente dispersión de los protoescólices, y sobre una hidatidosis secundaria en quistes desarrollados por inoculación intraperitoneal de protoescólices. Una de las herramientas utilizadas para determinar el efecto de los fármacos evaluados, tanto durante los estudios in vitro como in vivo, es la utilización de microscopía electrónica de transmisión (MET) y barrido (MEB) para analizar los efectos ultraestructurales producidos. Una de las condiciones para las muestras destinadas a su observación por MEB convencional, es que deben estar secas. El proceso de secado ha de llevarse a cabo preservando al máximo la estructura original de la muestra. Para ello, generalmente luego de la clásica fijación y deshidratación química, se realiza un secado por la técnica de punto crítico. Muchos laboratorios no poseen la infraestructura necesaria por lo que es necesario buscar métodos alternativos. Objetivo Evaluar el uso de Hexamethyldisilazane (HMDS) como método de procesamiento que involucre la manipulación de los parásitos sin la necesidad de punto crítico para su observación al MEB. Metodología Protoescólices obtenidos de quistes bovinos fueron incubados en medio 199 en presencia de las diferentes drogas a evaluar. Se utilizaron como control protoescólices incubados en medio 199. Se tomaron muestras para MEB a diferentes tiempos de incubación. Protoescólices (180 μl) fueron colocados en microtubos de 1,5 ml y fijados con glutaraldehído al 2,5 % en tampón cacodilato de sodio al 0,1 % durante 24 hs a 4 °C. Posteriormente, se realizaron 3 lavados de 15 minutos cada uno con tampón cacodilato. El material permaneció en el último lavado y se conservó a 4 °C hasta su procesamiento. Para su observación al MEB, los especímenes fueron colocados en recipientes de vidrio y deshidratados mediante la incubación secuencial en concentraciones ascendentes de etanol: 50 % (10 min), 70 % (10 min), 80 % (10 min), 90 % (10 min), 95 % (10 min), 100 % (10 min) 2 cambios. Finalmente se sumergieron durante 5 minutos, 1 hora y permanecieron semitapados toda la noche (18 hs) en HMDS. Una vez evaporado este último, fueron metalizados con oro (100 Å de espesor) para su posterior observación a 15 KV en un microscopio electrónico de barrido (JEOL JSM-6460 LV). Resultados El HMDS permitió el correcto secado de los protoescólices. Fue posible observar las características morfológicas de los parásitos control y evidenciar las alteraciones ultraestructurales producidas por los diferentes fármacos evaluados. Conclusión La utilización de HMDS para estos parásitos ha resultado satisfactoria ya que no se han evidenciado alteraciones estructurales de superficie. Este procedimiento resultaría una alternativa cuando no se posee la infraestructura necesaria para realizar punto crítico.