Estudio de dos nuevas fitoproteasas para su aplicación en biocatálisis en medios no convencionales

MORCELLE DEL VALLE, S.; BARBERIS, S.; PRIOLO, N.

Pavía, Italia

Congreso; XI Congreso Italo-Latinoamericano de Etnomedicina; 2002

SILAE

OBJETIVOS Informar la purificación y caracterización de dos fitoproteasas obtenidas del látex de Funastrum clausum (Jacq.) Schlechter (Asclepiadaceae), planta autóctona de Argentina, para ser aplicadas en la síntesis selectiva de péptidos en medios no convencionales en lugar de la síntesis química convencional. INTRODUCCION La mayoría de los procesos de catálisis enzimática se realizan en soluciones acuosas. Sin embargo muchos productos de reacción no pueden obtenerse en medio acuoso por distintas razones: insolubilidad de sustratos, posibilidad de contaminación microbiana, equilibrio termodinámico desfavorable, inhibición de la actividad enzimática debida a reactivos o productos, o dificultad para recuperar estos últimos. Estas dificultades pueden evitarse utilizando solventes orgánicos como medio de reacción, tanto en sistemas monofásicos como bifásicos. La principal desventaja es que las enzimas responsables de la bioconversión deseada resulten desnaturalizadas por los mismos. No obstante, es importante destacar que la actividad enzimática debe mantenerse lo suficientemente alta para la aplicación que se pretende. Por lo tanto, informamos la obtención de dos nuevas fitoproteasas y su estabilidad en diferentes sistemas de solventes a fin de determinar su potencial aplicación en la síntesis de péptidos bioactivos. MATERIALES Y MÉTODOS El látex de Funastrum clausum, recogido en buffer fosfatos de pH 7,5 con EDTA y cisteína 5 mM, centrifugado dos veces consecutivas de dos horas cada una a 10000 rpm a 4ºC, fue purificado en una columna de DEAE Sepharose Fast Flow, pH 7,5, gradiente 0-0,3 M NaCl (FPLC, Pharmacia), y posterior recromatografía en SP Sepharose Fast Flow a pH 6,5, gradiente de NaCl 0-0,4 M. Las fracciones obtenidas fueron caracterizadas a través de su pI, Mr, pH óptimo, zimograma y actividad caseinolítica y azocaseinolítica. Ensayos de estabilidad a la temperatura y en distintos sistemas de solventes fueron probados para el extracto crudo conteniendo ambas proteasas en diferentes sistemas monofásicos y bifásicos en proporciones 30:70, 50:50 y 70:30 de buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8,8 y los siguientes solventes: éter etílico, butanol, dicloroetano, hexano, benceno y clorobenceno (bifásicos), y N,N-dimetilformamida, acetonitrilo, dioxano, etanol, metanol, acetona y etilenglicol (monofásicos). Asimismo, fue probada la preferencia por sustratos sintéticos del tipo de los N-a-carbobenzoxi-p-nitrofenil ésteres de aminoácidos. RESULTADOS Se aislaron y purificaron dos proteasas del extracto crudo de Funastrum clausum (Jacq.) Schlechter (Asclepiadaceae), con un pI alcalino, masas moleculares comprendidas entre 25 y 27 kDa, pH óptimo entre 7,5 y 9,5 y estables en un amplio rango de temperaturas (25º y 70º C). Los ensayos de estabilidad mostraron que los sistemas monofásicos (etanol y metanol) son más apropiados que los bifásicos, ya que retienen la mayor actividad proteolítica residual. La máxima actividad endoesterolítica se obtuvo para el derivado de Ala, seguido de los derivados de Asn y Tyr.