APLICACIÓN DE PAPAÍNA INMOVILIZADA EN LA SÍNTESIS DE COMPUESTOS CON ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

FAIT, M.E.; ROSSI, S.A.; GARROTE, G.L.; MORCELLE, S.R.

Santa Fe

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos (SAProBio); 2014

INTRODUCCIÓN Papaína (E.C. 3.4.22.2), una endopeptidasa cisteínica vegetal obtenida del látex de Carica papaya, es una de las enzimas más empleadas en procesos Biocatalíticos, entre ellos la síntesis de derivados peptídicos, debido a su robustez y amplia especificidad. Su inmovilización en un soporte inerte permite aumentar no sólo la estabilidad de la enzima, sino también el rendimiento de reacción, facilitando a su vez la purificación del producto deseado. En este trabajo se detalla la síntesis de dos surfactantes catiónicos (Nα-benzoil-arginina decilamida, Bz-Arg-NHC10, y Nα-benzoil-arginina dodecilamida, Bz-Arg-NHC12) catalizada por papaína inmovilizada y la purificación de los mismos mediante metodologías ecocompatibles. Debido a la potencial aplicación de los compuestos sintetizados como agentes preservativos en formulaciones farmacéuticas, cosméticas y/o alimentarias, su actividad antimicrobiana fue evaluada utilizando dos cepas de microorganismos indicadores. METODOLOGIA Preparación del biocatalizador. Papaína (100 mg) fue disuelta en buffer bórico-borato 0,1 M pH 8,0 con 1 mM EDTA (1 ml) en presencia de DTT (150 mg). La solución resultante fue mezclada con el soporte sólido (1 g de poliamida-6, EP-700). El agua se eliminó por liofilización. Síntesis semipreparativa de Bz-Arg-NHCn y purificación por cromatografía de intercambio catiónico. Las reacciones fueron llevadas a cabo por incubación del biocatalizador (1 g) con la mezcla de sustratos, compuesta por Nα-benzoil-L-arginina etil éster (Bz-Arg-OEt, BAEE; 0,2 mmol) y la amina correspondiente (decil- o dodecilamina, 0,03 mmol) en 10 ml de acetonitrilo (ACN) conteniendo 0,25% v/v de agua, bajo atmósfera de N2, a 37°C y agitación (150 rpm), durante 72 horas. La reacción fue detenida por filtración del biocatalizador, seguida del lavado del mismo con ACN (3×10 ml) y éter (3×10 ml). Los productos fueron extraídos utilizando una mezcla MeOH/H2O 4:1 (3×10 ml) y los extractos se filtraron con una membrana de nylon (0,22 μm). La purificación de Bz-Arg-NHCn se llevó a cabo por cromatografía de intercambio catiónico (SP Sepharose Fast Flow) en un Äkta Purifier 10. Los solventes de elución fueron A: buffer bórico-borato 0,01 M, pH 8,5/etanol (1:1) y B: buffer bórico-borato 0,01 M, pH 8,5/etanol 1:1 con 1 M de NaCl. Los productos fueron eluídos isocráticamente con 31% de solvente B, flujo de 1 ml/min, λ de detección 215 y 254 nm. Los compuestos purificados fueron desalados e identificados por espectrometría de masas exactas (ESI MS). Ensayos de actividad antimicrobiana de Bz-Arg-NHCn. La actividad antimicrobiana fue evaluada frente a E. coli ATCC 11229 y St. aureus ATCC 6538 según el método de dilución en microplaca , testeándose un rango de concentraciones de 1,6 a 800 μg/ml para Bz-Arg-NHC10 y de 1,6 a 200 μg/ml para Bz-Arg-NHC12. Determinación de las cinéticas de muerte de Bz-Arg-NHCn. Se estudió el efecto de los surfactantes sobre la supervivencia de E. coli y St. aureus para concentraciones iguales a la CIM y la CIM/2 para cada cepa bacteriana. Soluciones de los surfactantes preparadas en caldo nutritivo fueron inoculadas con suspensiones bacterianas incubadas a 37°C. Se tomaron alícuotas a intervalos de tiempo predeterminados (0, 15, 30, 60, 180 y 360 min), se diluyeron en forma seriada y se plaquearon para realizar el recuento de bacterias viables en cada caso. RESULTADOS Y CONCLUSIONES Se realizó la síntesis a escala semipreparativa de Bz-Arg-NHC10 y Bz-Arg-NHC12 utilizando papaína adsorbida en poliamida como biocatalizador. Los rendimientos obtenidos fueron de 98% y 85% respectivamente. La purificación de los productos se realizó por cromatografía de intercambio catiónico. Dicha metodología es de baja toxicidad y bajo costo, ya que emplea mezclas acuoso-etanólicas como solventes, y representa una alternativa interesante para su producción a escala industrial, ya que es compatible también con la conservación del medio ambiente. Ambos compuestos sintetizados demostraron poseer actividad antimicrobiana. Las CIM (CBM) determinadas para Bz-Arg-NHC10 fueron de 200 μg/ml (200 μg/ml) para E. coli y 62 μg/ml (ND) para St. aureus, en tanto que para Bz-Arg-NHC12 las CIM (CBM) obtenidas fueron de 100 μg/ml (100 μg/ml) para E. coli y 25 μg/ml (50 μg/ml) para St aureus. Se determinó el efecto de los surfactantes sobre la supervivencia de E. coli y St. aureus. Para E. coli, se comprobó una disminución del número de bacterias viables de 4 logaritmos con respecto al número inicial luego de tres horas de incubación con Bz-Arg-NHCn (CIM). En el caso de St. aureus, Bz-Arg-NHC10 (CIM) produjo una disminución de 2 logaritmos, mientras que Bz-Arg-NHC12 (CIM) provocó una reducción de 4 logaritmos de la carga bacteriana inicial luego de tres horas de incubación. Los surfactantes obtenidos por biocatálisis no sólo inhibieron el desarrollo de los microorganismos ensayados, sino que además mostraron acción bactericida, lo que los convierte en promisorios agentes antimicrobianos.