Efecto de sustancias protectoras sobre la viabilidad de lactobacilos durante el estrés por liofilización y almacenamiento

MARÍA SILVINA JUÁREZ TOMÁS; ELENA BRU; GLADYS MARTOS; MARÍA ELENA NADER-MACÍAS

Buenos Aires. Argentina.

Congreso; BAIRESBIOTEC 2005Congreso Internacional Grupo Biotecnología. VI Simposio Nacional de Biotecnología REDBIO Argentina 2005. Encuentro Trinacional REDBIO Argentina-Chile-Uruguay; 2005

REDBIO Argentina. Grupo Biotecnología.

Los lactobacilos han sido ampliamente propuestos como microorganismos probióticos empleados para restaurar el equilibrio del ecosistema del tracto urogenital (Lepargneur y Rousseau, 2002). Los microorganismos potencialmente probióticos deben resistir a las condiciones adversas del proceso industrial de producción de biomasa y conservación (por ejemplo, por liofilización). A fin de evitar o reducir la injuria de las células microbianas durante la liofilización (Castro et al., 1997), en el presente trabajo se evaluó el efecto de diferentes crioprotectores sobre la viabilidad de tres cepas de lactobacilos vaginales durante el estrés por liofilización y conservación en el tiempo. Metodología Lactobacillus gasseri CRL 1259, L. johnsonii CRL 1294 y L. salivarius CRL 1328, seleccionados previamente por sus propiedades benéficas (Ocaña et al. 1999), se sub-cultivaron tres veces en LAPTg caldo a 37°C. El último cultivo, concentrado 10 veces, se resuspendió en las mezclas protectoras: sacarosa 12%, lactosa 12%, leche 6%, sacarosa 12% en leche 6%, y lactosa 12% en leche 6%. Las suspensiones se liofilizaron en ampollas de vidrio, las cuales se almacenaron a 7°C. Se determinó viabilidad antes y después del proceso de liofilización, y en períodos de 6 meses, durante 2 años, por duplicado. Se aplicó el test de Scheffé para evaluar estadísticamente la pérdida de viabilidad durante el proceso de liofilización. Para comparar el efecto de los diferentes crioprotectores sobre la viabilidad de cada microorganismo durante el almacenamiento, se realizó el análisis de la varianza con medidas repetidas en el tiempo. Resultados y Discusión En cada microorganismo, las sustancias más efectivas para proteger a las células microbianas durante la liofilización fueron aquellas en las que la pérdida de viabilidad no fue significativa (Tabla 1): L. gasseri CRL 1259 en lactosa o lactosa/leche (pérdida de viabilidad de aproximadamente 0,25 unidades log, con un promedio de 52% de recuperación); L. johnsonii CRL 1294 en lactosa/leche (0,54 y 0,11 unidades log, respectivamente, de diferencia entre recuentos pre y post-liofilización, correspondientes a 24 y 78% de recuperación); y L. salivarius CRL 1328 en los tres protectores individuales, siendo mayor la recuperación en lactosa (62%, con una disminución de 0,19 unidades log). Tabla 1. Efecto de medios crioprotectores sobre la viabilidad de lactobacilos vaginales durante el proceso de liofilización. Cepa Medio protector A B (A-B) L. gasseri CRL 1259 Sacarosa 9,761 9,062 0,70 Lactosa 9,401 9,161 0,24 Leche 9,911 9,062 0,85 Sacarosa/Leche/ 9,911 9,332 0,58 Lactosa/ Leche 9,801 9,551 0,25 L. johnsonii CRL 1294 Sacarosa 8,701 6,532 2,17 Lactosa 8,481 6,182 2,30 Leche 8,691 7,442 1,25 Sacarosa/Leche/ 9,071 8,512 0,56 Lactosa/ Leche 8,931 8,821 0,11 L. salivarius CRL 1328 Sacarosa 10,691 9,941 0,75 Lactosa 10,251 10,061 0,19 Leche 10,271 9,421 0,85 Sacarosa/Leche/ 10,521 8,782 1,74 Lactosa/ Leche 10,401 9,332 1,07 A: Log UFC/ml pre-liofilización; B: Log UFC/ml post-liofilización; (A-B): Diferencia recuentos pre y post-liofilización. 1,2 Superíndices diferentes indican diferencias significativas (p < 0,05) entre los recuentos pre y post-liofilización en cada medio protector. La respuesta al estrés por almacenamiento en forma de cultivos liofilizados dependió de cada microorganismo y crioprotector empleado. En L. gasseri CRL 1259, leche fue el protector menos efectivo, con pérdida significativa de viabilidad (4 unidades log) en los tres primeros meses de almacenamiento. En cambio, en las condiciones restantes se recuperaron entre 1 x 107 y 1 x 108 UFC/ml (máximo porcentaje de sobrevida en lactosa) a los 24 meses de conservación.La respuesta al estrés por almacenamiento en forma de cultivos liofilizados dependió de cada microorganismo y crioprotector empleado. En L. gasseri CRL 1259, leche fue el protector menos efectivo, con pérdida significativa de viabilidad (4 unidades log) en los tres primeros meses de almacenamiento. En cambio, en las condiciones restantes se recuperaron entre 1 x 107 y 1 x 108 UFC/ml (máximo porcentaje de sobrevida en lactosa) a los 24 meses de conservación. La mayor sobrevida de L. johnsonii CRL 1294 durante la conservación se observó en las condiciones que protegieron mejor durante el proceso de liofilización (Tabla 1). En tales condiciones, los porcentajes de recuperación a los 24 meses fueron bajos: 7 x 105 UFC/ml (0,1% de sobrevida) en leche/lactosa, y 5 x 104 UFC/ml (0,02% de sobrevida) en leche/sacarosa. En L. salivarius CRL 1328, sacarosa individualmente mostró un efecto estadísticamente diferente a los protectores restantes, y perjudicial sobre este microorganismo conservado durante 24 meses. La condición óptima de almacenamiento liofilizado fue lactosa/leche, sin pérdida significativa de viabilidad durante dos años de conservación (40% de sobrevida). Los efectos protectores de lactosa, leche y leche/sacarosa fueron estadísticamente semejantes entre sí, con valores finales de células viables entre 3 y 6 x 107 UFC/ml. Conclusiones En L. gasseri CRL 1259 la liofilización en presencia de lactosa individualmente permitió obtener una mayor viabilidad en el tiempo. En cambio, en los microorganismos restantes, fue necesaria la mezcla de un hidrato de carbono en leche. L. salivarius CRL 1328 fue el microorganismo más resistente a la conservación por liofilización, sin presentar pérdida significativa de viabilidad durante 2 años en lactosa/leche.