Alternativas terapéuticas en modelos murinos de leishmaniasis: uso de PCR en tiempo real para su evaluación

GARCÍA BUSTOS MF; CRISTÓBAL H; GONZÁLEZ PRIETO G; BARRIO A; POMA R

Anales de la Fundación Alberto J. Roemmers

Ediciones Médicas del Sur S.R.L

Lugar: CABA; Año: 2017; p. 176 - 178

Introducción: La leishmaniasis, enfermedad causada por parásitos del género Leishmania, constituye un problema de salud y social en muchos países, presentando la provincia de Salta la mayor endemicidad dentro de Argentina. Su tratamiento convencional, el antimoniato de meglumina (AM) tiene numerosas dificultades, como invasividad en su administración, toxicidad, y falla terapéutica creciente, que justifican la búsqueda de alternativas terapéuticas. La bibliografía disponible muestra la utilidad de los modelos murinos de leishmaniasis para la realización de ensayos preclínicos con drogas candidatas, y la extrapolación de los resultados obtenidos a la enfermedad humana. Contamos con un modelo murino de infección por Leishmania, en el cual hemos evaluado distintas alternativas terapéuticas a la quimioterapia convencional. Hasta el momento, la evaluación de la eficacia de los distintos tratamientos la hemos realizado mediante medición de lesiones, determinación de anticuerpos antileishmania por ELISA, histopatología, índice esplénico y PCR convencional. La PCR en Tiempo Real (RT-PCR) surge actualmente como una mejor opción para testear la eficacia a drogas y el seguimiento postratamiento, ya que no sólo permite detectar la presencia de material genético, sino además determinar la carga parasitaria. Por este motivo, nos propusimos evaluar la utilidad de esta técnica para medir, en un modelo experimental de leishmaniasis por Leishmania (Leishmania) amazonensis, la eficacia de un tratamiento determinado. Materiales y métodos: Se trabajó con muestras de tejido (almohadilla plantar) incluido en parafina, provenientes de ratones infectados con L. (L.) amazonensis y sometidos a distintos tratamientos (AM, miltefosina y placebo). La extracción de ADN de los tejidos parafinados se realizó mediante un kit comercial (FFPE Tissue DNA Isolation Kit Biostic®, laboratorios Mo Bio). La RT-PCR se llevó a cabo empleando Mezcla Real (Biodynamics, que contiene fluorocromo verde), oligonucléotidos 13A y 13B, y colorante High ROX. Para optmizar la técnica se probaron distintas concentraciones de primers y temperaturas de annealing. Para la curva de calibración, se utilizó un cultivo de parásitos (L. (L.) amazonensis). Luego de la extracción de ADN con fenolcloroformo, se realizaron diluciones sucesivas en un factor de 10 en el rango de 6.108 a 6.10-5 parásitos/300 μL de buffer TE, que fueron empleadas como puntos de la curva de calibración necesarios para la cuantificación de ADN en las muestras incógnitas. Resultados: La curva de calibración óptima para la RT-PCR se obtuvo con una concentración de primers de 0,2 μM y 62 °C de annealing. La eficiencia fue de 89%, y el límite de detección fue de 10-1 parásitos/pocillo. El resultado del análisis de las muestras de tejido mostró una mayor sensibilidad de la RT-PCR respecto a los obtenidos previamente mediante técnicas parasitológicas directas, serológicas y PCR convencional. Muestras que resultaron negativas por otros métodos, mostraron mediante RT PCR persistencia de parásitos, aunque con carga parasitaria baja. Conclusión: La mayor sensibilidad de la RT-PCR permitió determinar, en términos del modelo murino experimental, que la ausencia total de parásitos (cura estéril) luego del tratamiento es difícil de lograr. Sin embargo, en términos de progresión de la enfermedad, una baja carga parasitaria indicaría un mejor pronóstico para el hospedador.