Separación de peroxidasa recombinante y baculovirus brotado a partir de sobrenadantes de cultivo de células de insecto por cromatografia de intercambio iônico

LEVIN G.; TARGOVNIK A; ROMERO L.; CASCONE O.; MIRANDA MV.

CABA Argentina

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología.; 2008

La isoenzima C de peroxidasa (HRP C) es una enzima vegetal con actividad de oxidorreductasa. Estructuralmente está compuesta por una única cadena peptídica de 308 aminoácidos con cuatro puentes disulfuro, un grupo prostético hemo, 2 átomos de calcio y ocho sitios de glicosilación. La enzima se expresa funcionalmente activa en sobrenadantes de cultivo de células de insectos infectados con baculovirus recombinante. Cuando se requiere purificar el producto de expresión extracelular en este sistema se debe atender a la separación de las células, de las proteínas del suero fetal bovino y del virus recombinante brotado presente en alto título tras varios días postinfección. Para expresar HRPC recombinante, se construyó un vector de Baculovirus de Autographa californica (AcMNPV) que expresa el producto bajo el control del promotor fuerte y tardío de poliedrina en cultivo de células de insecto Sf9. La presencia de una señal de secreción dirige la exportación de la proteína al medio extracelular. En el extremo carboxilo de la HRP C se adicionó un tag de 6 residuos de arginina que elevó el punto isoeléctrico a 9,5. Se logró purificar HRP C con un rendimiento del 98,5% y un índice de purificación de 17,5 a partir de un sobrenadante de cultivo (6 días postinfección) por cromatografía en HiTrap SP FF (GE) a pH 8,5. Los geles de Dot Blot indicaron la presencia de virus en las fracciones de lavado de la matriz cromatográfica no así en la fracción de elución cuando se reveló con anticuerpos específicos para la glicoproteína viral GP64 presente en la superficie de la envoltura de los virus brotados. La fracción eluída con buffer Tris/HCl 5 mM pH 8,5, NaCl 0,8M presentaba la HRP C libre de partículas virales. Se purificó DNA de la fracción de elución y se amplificó por PCR una secuencia de 160 pb dentro del gen de HRP C. La ausencia de fragmentos de PCR permitió confirmar que el producto se encontraba libre de virus infectivo. Por otra parte, se sembró baculovirus concentrado por ultracentrifugación en colchón de sacarosa 30% en la columna HiTrap SP FF (GE) equilibrada con buffer MES a pH 5,8 para observar el comportamiento cromatográfico del virus en esta matriz. La elución con PBS pH 7,4 reveló la presencia de partículas virales mediante la técnica de Dot Blot. De esta forma se confirmó la interacción entre las partículas virales y la matriz de sulfopropil Sepharose en las condiciones ensayadas. El diseño del tag de arg nos permitió obtener una proteína recombinante de alto punto isoeléctrico funcionalmente activa semejante a la enzima nativa. La aplicación de esta estrategia de purificación permite en un solo paso recuperar el producto recombinante libre de virus y de proteínas de suero ya que estos contaminantes presentan valores de puntos isoeléctricos inferiores a 8,0. Por otra parte, el tag de arg puede ser eventualmente eliminado por acción controlada con  carboxipeptidasa B.